Розробка експрес-методу для виявлення та генотипування штамів Н1N1 та Н7N9 вірусу пташиного грипу а за допомогою ПЛР – ПДРФ аналізу

Autor: Buriachenko, Semen, Stegniy, Borys
Jazyk: ukrajinština
Rok vydání: 2019
Předmět:
Zdroj: ScienceRise: Biological Science; № 3 (18) (2019); 9-20
ISSN: 2519-8017
2519-8025
Popis: Epizootic monitoring in recent years suggests that the highly pathogenic avian influenza A virus (H1N1) and (H7N9) actively circulate in the Eurasian countries. By 2016 - 2019 1.6 thousand outbreaks were recorded. For 2016 - 2019, 1.6 thousand cases of outbreaks were recorded. Of these, there are 872 cases in Europe. The monitoring of infected birds, both migratory and poultry, in places of cross-contact in Ukraine is relevant for preventing outbreaks of epizooties.The aim of the study. To develop an express method for the identification and determination of bird flu virus A H1N1 and H7N9 strains, based on a polymerase chain reaction with analysis of restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) of the virus RNA.Results and discussion. The in silico analysis of the HA, NA, and NP gene amplicons allowed in silico to calculate the primers to the variable loci of the investigated genes, to calculate the reaction conditions, to determine restriction sites for the restriction enzyme to obtain theoretical PCR electrophoregrams. An express method for the detection and identification of influenza A H1N1 and H7N9 virus by three genes (HA, NA, and NP) of H1N1 and H7N9 RNA in polymerase chain reaction, combined with RFLP analysis, was developed. The method of rapid diagnostics is able to detect avian influenza virus A H1N1 and H7N9 and differentiate it from samples of other pathogens of viral infections of birds and animals. It was established, that the PCR-RFLP rapid diagnostic method is able to detect influenza A virus RNA of H1N1 and H7N9 strains with high sensitivity (100 % sensitivity).Conclusions.The developed method of PCR-based rapid identification, combined with RFLP analysis, makes it possible to significantly simplify the method of identification due to specific amplification of an RNA region having a polymorphic restriction site. Testing of this locus is possible by pre-PCR and restriction of the amplified fragment. The method of express - diagnosis of PLR-RFLP has been established for detecting RNA virus influenza A of high pathogenic H1N1 and H7N9 strains with high indicators of sensitivity (100 % sensitivity)
Эпизотический мониторинг последних лет свидетельствует о том, что высокопатогенный вирус гриппа А птиц (H1N1) и (H7N9) активно циркулирует на территории Евразийских стран. За 2016 – 2019 гг. Было зафиксировано 1,6 тыс. случав вспышек. Из них в Европе 872 случая. Вопрос мониторинга за инфицированной как перелетной так и домашней птицей в местах перехресного контакта в Украине является актуальным для предотвращения возникновения вспышек епизотий.Цельисследования. Разработать экспресс - метод идентификации и определения вируса птичьего гриппа А Н1N1 и Н7N9 штаммов на основе полимеразной цепной реакции с анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ) РНК вируса.Результаты и обсуждение. Проведеный анализ in silico ампликонов генов HA, NA и NP позволил расчитать праймеры к вариабельным локусам исследуемых генов, расчитать условия проведения реакции, определить сайты рестрикции к подобранным рестриктазам,получить теоретические электрофореграммы ПЦР - ПДРФ анализа. Разработано методику экспресс – методадля определения и идентификации вируса гриппа А H1N1 и H7N9 потрем генам (HA, NA, и NP) РНК H1N1 и H7N9 в полимеразной цепной реакции совмещенный с ПДРФ анализом. Метод экспресс – диагностики способный выявлять вирус птичьего гриппа А H1N1 и H7N9 идифференцировать его от образцов других возбудителей вирусных инфекций птиц и животных. Установлено, что метод экспресс – диагностики ПЦР-ПДРФ способенвыявлять РНК вируса гриппа А штаммов H1N1 и H7N9 с высокими показателямичуствительности(100 % чуствительность).Выводы.Разработанный метод экспресс – идентификации на основе ПЦР совмещенный с ПДРФ анализом дает возможность значинтельно упростить метод идентификации за счет специфической амплификации участка РНК, который имеет полиморфный сайт рестрикции. Тестирование состояния этого локуса возможно путем предварительного проведения ПЦР и рестрикции амплифицированого фрагмента. Установлено, что метод экспрес – диагностики ПЦР-ПДРФ способен выявлять РНК вирус гриппа А высокопатогенных штаммов H1N1 и H7N9 с высокими показателями чуствительности (100 % чуствительность).
Епізоотичний моніторинг останніх років свідчить про те, що високопатогенний вірус грипу А птахів (H1N1) та (H7N9) активно циркулює на території Євразійських держав. За 2016 – 2019 рр. було зафіксовано1,6 тис. випадків спалахів. З них у Європі 872 випадки. Питання моніторингу за інфікованою як перелітною так і свійською птицею в місцях перехресного контакту в Україні є актуальним для запобігання виникнення спалахів епізоотії.Мета дослідження. Розробити експрес – метод ідентифікації та визначення вірусу пташиного грипу А Н1N1 та Н7N9 штамів на основі полімеразної ланцюгової реакції з аналізом поліморфізму довжин рестрикційних фрагментів (ПЛР-ПДРФ) РНК вірусу.Результати та обговорення. Проведений аналіз in silico ампліконів генів HA, NA та NP дозволив in silico розрахувати праймери до варіабельних локусів досліджуваних генів, розрахувати умови проведення реакції, визначити сайти рестрикції до добраних рестриктаз отримати теоретичні електрофореграми ПЛР - ПДРФ аналізу. Розроблено методику експрес – методу для виявлення та ідентифікації вірусу грипу А H1N1 та H7N9 за трьома генами (HA, NA та NP) РНК H1N1 та H7N9 у полімеразній ланцюговій реакції ПЛР суміщеній з ПДРФ аналізом. Метод експрес – діагностики здатний виявляти вірус пташиного грипу А H1N1 та H7N9 і диференціювати його від зразків інших збудників вірусних інфекцій птахів і тварин.Висновки. Розроблений метод експрес – ідентифікації на основі ПЛР суміщений з ПДРФ аналізом дає можливість значно спростити метод ідентифікації за рахунок специфічної ампліфікації ділянки РНК, що має поліморфний сайт рестрикції. Тестування стану цього локуса можливе шляхом попереднього проведення ПЛР та рестрикції ампліфікованого фрагменту. Встановлено, що метод експрес – діагностики ПЛР-ПДРФ здатний виявляти РНК вірус грипу А високопатогенних штамів H1N1 та H7N9 з високими показниками чутливості (100 % чутливість)
Databáze: OpenAIRE
Externí odkaz: