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NP185, a neuronal-specific protein of 185 kDa, was first discovered when we prepared monoclonal anti-bodies (mAbs) against bovine brain clathrin coated vesicles. Two mAbs, 8G8 and 6G7, permitted us to characterize this protein both biochemically and in development (NP185 is expressed in a NGF-dependent manner in PC12 cells). The expression of NP185 coincides with synaptogenesis. In this work, we have further characterized this protein as follows: Microsequence analysis of immuno-purified native NP185 from bovine brain yielded five peptides that corresponded exactly to the known sequences of murine F1-20 and rat AP180 (renamed AP3); ii) Using an established assay, we show that purified recombinant NP185/AP3 can facilitate clathrin cages assembly; iii) Using deletion mutagenesis, we mapped the epitopes of two distinct mAbs directed against bovine NP185 to a 60 amino acid residue region of the murine recombinant NP185/AP3; iv) Recombinant NP185/AP3 can be phosphorylated by purified casein kinase II in vitro; and v) Recombinant NP185/AP3 directly binds to purified brain tubulin. Since NP185/AP3 binds to tubulin and stimulates the clathrin assembly, it may be involved in the regulation of the transport of clathrin-coated vesicles. Casein kinase II, an enzyme known to be present in clathrin-coated vesicles, may play a role in the regulation of NP185/AP3 for the promotion of clathrin assembly.La NP185 es un polipéptido específico de las células neuronales y de una masa molecular de 185 kilo-Daltons. Esta proteina la descubrimos originalmente cuando preparábamos anticuerpos monoclonales usando como antígeno el complejo proteico de clatrina extraído de vesículas cubiertas en cerebro de bovino.Dos anticuerpos monoclonales, que llamamos 8G8 y 6G7, nos permitieron visualizar y caracterizar anteriormente la proteina NP185. Esas características fueron estudiadas e identificadas bioquímicamente y en desarrollo embrionario. Encontramos también que la proteina NP185 se expresaba en las células tumorales de tejido renal PC12, cuando estas células son estimuladas con el Factor de Crecimiento de Nervios (NGF). En esos estudios usamos cerebro de embriones de pollo y encontramos que el momento en que comienza la expresión genética de NP185 coincide con la formación funcional de las terminaciones sinápticas.En el trabajo que describimos a continuación usamos métodos basados en principios genéticos y hemos avanzado nuevamente en nuestro entendimiento sobre las propiedades de la proteina NP185. Hemos elucidado las siguientes características:A) Con un análisis de micro-secuencia de aminoácidos obtuvimos cinco fragmentos de moléculas péptidas que pertenecen a distintas regiones del polipéptido NP185 de cerebro bovino. Estas regiones también corresponden exactamente a las secuencias que fueron reconocidas en la proteina de laucha F1–20 y en la proteina de rata AP180 (llamada recientemente AP3).B) Usando métodos establecidos anteriormente hemos demostrado que la proteina NP185/AP3 purificada por métodos de genética recombinante facilita la reconstrucción de las jaulas de clatrina.C) Usando borramiento de mutaciones genéticas hemos delineado los sitios antigénicos de dos anti-cuerpos monoclonales diferentes que reaccionan con la proteina NP185 de bovino. Estos sitios anti-génicos corresponden a una región de aminoácidos de la proteina recombinante NP185/AP3 que tiene 60 residuos de aminoácidos.D) La proteina recombinante NP185/AP3 puede serfosforilada con la enzima purificada de kinasa de caseína tipo II.Finalmente, E) La proteina recombinante NP185/AP3 se acopla directamente a tubulina. En esa forma estimula la reorganización y formación de jaulas de clatrina. Por lo tanto asumimos que la proteina NP185/AP3 se encuentra involucrada en el transporte regulado de vesículas cubiertas con clatrina en el citoplasma de las células neuronales de cerebro. Basándonos en estos resultados proponemos que la kinasa de caseína tipo II, es una enzima que acompaña a las vesículas cubiertas en célylas nerviosas del tejido de cerebro. Las vesículas cubiertas de clatrina participan así en el transporte de porciones de membrana sináptica y facilitan la secresión de sustancias químicas neuronales de transmisión de impulsos nerviosos en cerebro. |
