腺相关病毒包装条件优化及重组AAV8/hFⅧ基因治疗血友病A小鼠的实验研究
| Jazyk: | angličtina |
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| Rok vydání: | 2020 |
| Předmět: | |
| Zdroj: | Chinese Journal of Hematology |
| ISSN: | 2707-9740 0253-2727 |
| Popis: | 目的 评价携带人凝血因子FⅧ（hFⅧ）的重组腺相关病毒（AAV）血清型8（AAV8/hFⅧ）病毒治疗血友病A（HA）小鼠效果。 方法 应用pAAV-CB-EGFP，pH22（AAV2血清型）和pfΔ6（腺病毒辅助质粒）摸索在HEK-293细胞中AAV的包装条件，pH22、pfΔ6及pAAV-CB-EGFP质粒按照1∶1∶1的比例进行转染，免疫荧光显微镜观察四个条件（包括10 cm培养皿转10 µg质粒，20 cm培养皿分别转20、30和40 µg质粒）的病毒包装效果。应用最佳包装条件在HEK-293细胞中包装AAV2-EGFP，通过冻融法获得AAV2粗提液，感染HEK-293细胞和16095细胞，应用荧光显微镜观察包装效果。应用最佳转染条件将pAAV-TTR-hFⅧ、pH28、pfΔ6按1∶1∶1的比例转染HEK-293细胞获得AAV8/hFⅧ，两轮的氯化铯梯度离心法纯化病毒，以8×1012 vg/kg剂量经尾静脉注射HA小鼠进行基因治疗，活化部分凝血活酶时间（APTT）测定分析FⅧ的活性。 结果 20 cm培养皿转染20 µg质粒的条件能够在24、48和72 h都达到最佳的转染效果，且该条件包装的AAV2粗提液在16095细胞中具有较高的感染率。HA小鼠体内AAV8/hFⅧ能够在注射后12周仍有维持在治疗水平的FⅧ活性。 结论 利用优化包装条件制备的AAV8/hFⅧ能够在HA小鼠体内有效维持治疗水平的FⅧ活性达12周。 |
| Databáze: | OpenAIRE |
| Externí odkaz: |
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