| Popis: |
Bacillus anthracis is the anthrax causative agent. For its epidemiology, it is important not only to identify the etiological agent but also to determine the patterns of its evolution and spread. Modern methods of molecular biology make it possible to detect a number of genetic markers suitable for indicating and differentiating the strains of B. anthracis, including the loci arranged as variable number tandem repeats (VNTRs) and SNPs, one nucleotide-sized differences in the DNA sequence of the loci being compared. The objective of the present study was to examine the effectiveness of SNP analysis and PCR amplif ication of VNTR loci combined with the high-resolution amplicon melting analysis for identif ication and differentiation of the anthrax agent strains. In the study, seven strains of B. anthracis obtained from soil samples and animal carcasses were investigated using vaccine strain STI-1 as a reference. For molecular genetic characterization of these bacteria, analysis of 12 SNPs and variability analysis of eight VNTR loci were carried out. To detect the differences between the strains, their PCR product melting points were measured in the presence of the EvaGreen (Sintol, Russia) intercalating dye. For SNP detection, a PCR assay with double TaqMan probes was applied. It was found that the studied virulent strains, except for B. anthracis No. 1 and 3, could not be attributed to any phylogenetic subgroup of the anthrax agents. The proposed method made it possible to differentiate four out of the seven investigated strains. Strains No. 5-7 had identical SNP and HRM prof iles and, as a result, formed a single cluster. Our investigation has conf irmed that the proposed method can be successfully used for preliminary analysis of an epizootic situation in the case of anthrax.Бактерии Bacillus anthracis являются возбудителем сибирской язвы. Для эпидемиологии этой инфекции имеет значение не только идентификация этиологического агента, но и выяснение закономерности его эволюции и распространения. Современные методы молекулярной биологии позволяют определить ряд генетических маркеров, пригодных для индикации и дифференциации штаммов B. anthracis. К таким маркерам относят VNTR-локусы – последовательности, организованные в геноме в виде тандемных повторов, а также SNP – отличия в последовательности ДНК в сравниваемых локусах размером в один нуклеотид. Целью настоящей работы была оценка эффективности совместного применения SNP-анализа и ПЦР-амплификации VNTR-локусов с анализом температуры плавления ампликонов высокого разрешения для идентификации и дифференциации штаммов возбудителя сибирской язвы. Исследовали семь штаммов B. anthracis, полученных из образцов почвы и трупов животных, в качестве референс-микроорганизма был вакцинный штамм B. anthracis СТИ-1. Для молекулярно-генетической характеристики данных бактерий проведен анализ 12 однонуклеотидных полиморфизмов, а также вариабельности восьми VNTR-локусов, для определения различий в которых был впервые использован метод определения температур плавления ПЦР-продуктов в присутствии интеркалирующего красителя EvaGreen (ЗАО «Синтол», Россия). Для детекции SNP применен метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием двойных TaqMan-зондов. Обнаружено, что все изучаемые вирулентные штаммы, кроме B. anthracis № 1 и 3, по SNP-профилю не могут быть отнесены к какой-либо филогенетической подгруппе возбудителя сибирской язвы. Методический подход, включающий в себя анализ SNP- и VNTR-последовательностей, позволил диффе- ренцировать между собой штаммы B. anthracis № 1–4, в то время как бактерии B. anthracis № 5–7 демонстрируют одинаковые SNP- и HRM-профили и, как следствие, формируют один кластер. Таким образом, показана принци- пиальная возможность использования рассмотренной в этой работе методики для предварительного анализа эпизоотической ситуации при вспышках сибирской язвы. |
