| Popis: |
Angiogenese beschreibt die Neuaussprossung von Blutgefäßen aus bereits existierenden Gefäßen. Sie spielt eine zentrale Rolle in physiologischen Prozessen wie Embryogenese und entzündlichen Geschehnissen. Aber auch in pathologischen Abläufen ist die Angiogenese durchaus beteiligt. Zur Versorgung des Tumors mit O2 und Nährstoffen sind Blutgefäße unverzichtbar, auch die Auswanderung von Krebszellen zu entfernten Lokalitäten wird erst durch die Blutbahn ermöglicht. Die Erforschung von pro- und antiangiogenetischen Substanzen ist daher von hoher Wichtigkeit. Die Chorioallantoismembran (CAM) des Hühnerembryos kann als zuverlässiges Modell für die Untersuchung von Angiogenese verwendet werden. CAM ist ein hoch-vaskularisiertes, extraembryonales Gasaustauschorgan unter der Eischale. Testsubstanzen werden auf Kollagen-Grids aufgetragen und auf die CAM platziert. Nach 72-stündiger Inkubation wachsen die neuen Gefäße ein, diese werden fotografiert und mittels Machine-Learning analysiert. Die entsprechende Software wurde von IKOSA® entwickelt. Image-Analyse Programme erlauben objektive und schnelle Quantifizierung der Angiogenese. Automatisierte Quantifizierungsverfahren bedürfen aber Optimierungsmaßnahmen. Ziel der Arbeit war es, die während dem Durchführen von den Experimenten beobachteten Mängel zu dokumentieren und den Entwickler bei der Optimierung der Software zu unterstützen. Visualisierung der Angiogenese soll durch Immunhistochemie (IHC) ermöglicht werden. Hierzu kann ein anti-von-Willebrand-Faktor (vWF) Antiköper verwendet werden. Beim vWF handelt es sich um ein Endothelzellen spezifisches Antigen. Um ein möglichst spezifisches Binden des Antikörpers an das Antigen zu ermöglichen, muss ein passendes Antigen-Retrieval (AR) und eine entsprechende Verdünnung des Antikörpers gefunden werden. Durch den Vergleich von zwei AR Lösungen soll das IHC Protokoll optimiert werden. Citrat- und EDTA Puffer wurden im Rahmen dieses Projektes gegenübergestellt. Es wurde überprüft, welche der Lösungen ein spezifisches Binden des Antikörpers fördert, während gleichzeitig einer nicht-spezifischen Hintergrundfärbung entgegengewirkt wird. Mit AR mit EDTA und einer 1:500 Verdünnung des Primär-Antikörpers wurden die besten Ergebnisse erzielt. Angiogenesis describes the sprouting of new vessels from pre-existing vessels. Formation of new vessels is associated with physiological processes such as embryogenesis and inflammation, but also takes part in pathological events like the growth of tumours and metastasis. Tumours require O2 and nutrients provided through the blood stream. Cancer cells take over vascular structures to spread, making the vascular system vital to metastasis. Investigation of pro- and antiangiogenic properties of biomolecules is of utmost importance in biomedical research. The chorioallantoic membrane (CAM) of the chick embryo proved itself as a reliable model for angiogenesis. The CAM itself is a highly vascularized,extraembryonic membrane that serves as the respiratory organ to the chick embryo. Test substances are applied onto collagen grids and transferred to the membrane. After 72 hours of incubation, microscopy pictures of each grid are taken and analysed using a machine learning tool. The software was developed by IKOSA®. Image-analysis tools allow objective and fast quantification of neoangiogenesis. However, image-analysis software requires further optimization. The aim of this work was to document observed problems during the experiments in order to support the developer in optimizing the software. Visualization of angiogenesis in the CAM is made possible by immunohistochemistry of an endothelial cell specific marker called von Willebrand factor (vWF) antibody. To optimize the IHC protocol, the ideal Antigen-Retrieval (AR) solution and dilution of the primary antibody needs to be researched. By comparing two AR solutions, the IHC protocol is improved further. Citrate buffer and EDTA buffer were compared in this project. High target-binding with a lack of non-specific background staining were the prerequisites for an efficient AR solution. AR with EDTA and a 1:500 dilution of the antibody produced the best results. Bachelorarbeit FH JOANNEUM 2022 |
