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Kurzfassung Signal transducer and activator of transcription 5 (Stat5) sind zwei eng verwandte Proteine (Stat5a und Stat5b), die eine wichtige Rolle bei der hämatopoetischen Differenzierung, Proliferation und Überlebensrate spielen. Beim Menschen ist der Transkriptionsfaktor STAT5B bei einer Vielzahl von hämatopoetischen Malignitäten konstitutiv aktiviert. Eine hyperaktive Mutation in humanem STAT5B Gens, STAT5bH642H, wird wiederholt bei Patienten mit Lymphom / Leukämie gefunden. Obwohl Stat5 von grossem Interesse für therapeutische Ansätze und wissenschaftliche Studien ist, gibt es noch viel über seine Rolle bei der Hämatopoese und Leukämogenese zu lernen. Diese Studie zielt darauf ab, die Auswirkungen von zwei hyperaktiven gain of function Mutationen bei transgenen Mäusen zu untersuchen: Stat5aS710F und hSTAT5BN642H. Die gain of function Mutationen Stat5aS710F (S5a) und Stat5bN642H (S5b) führen zu letalen Thymomen, die undifferenzierte und differenzierte T-Zellen enthalten. Interessanterweise können beide Mutationen Thymome induzieren, unter dem genetischen Hintergrund eines Rag2 (Rag2 -/-) Mangels (als R2S5a und R2S5b bezeichnet) - ein Phänomen, das die Augen öffnet, da T-Zellen in Mäusen mit Rag2-Mangel in einem undifferenzierten Zustand blockiert sind, weil die erforderliche V (D) J Rekombination nicht erfüllt wird. Die Hauptfragen in dieser Arbeit sind (1) zu verstehen, wie die Hyperaktivierung von Stat5 Krankheiten verursachen kann, (2) die Unterschiede zwischen der Hyperaktivierung von Stat5a und Stat5b zu identifizieren, (3) zu sehen, ob R2S5a- und R2S5b-Zellen echten T-Zellen ähneln. Schlussendlich stellt dieser Datensatz eine wertvolle Ressource dar zur Untersuchung der Wildtyp-T-Zelldifferenzierung, die bisher nicht veröffentlicht wurde. Um diese Fragen zu beantworten, verwendeten wir einen RNA-seq-Ansatz, bei dem ich eine bioinformatische Analyse durchführte, einschließlich RNA-seq-Datenanalyse (Bewertung der Probenqualität, Analyse der differentiellen Expression, Analyse der Genontologie, Analyse der Anreicherung von Gen-Sets), Generierung von Datenexplorationswerkzeugen und Interpretation von Ergebnissen. In dieser Arbeit präsentiere ich die Analyse von RNA-Seq-Daten aus verschiedenen Stadien der T-Zell-Differenzierung unter verschiedenen genotypischen Bedingungen (Wildtyp, Stat5aS710F, Stat5bN642H, Rag2 - / -; Stat5aS710F, Rag2 - / -; Stat5bN642H; Rag2 - / -), die Definition von neuen Gen-Sets, die einem Muster des Wildtyps folgen, jedoch nicht Rag2 - / -; Stat5aS710Für Rag2 - / -; Stat5bN642HT-Zelldifferenzierung und die Schlussfolgerung, dass beide hyperaktiven Stat5 Versionen T-Zelldifferenzierungskontrollpunkte umgehen und Zellen hervorbringen, die die charakteristischen Zelloberflächenmarker CD4 und CD8 exprimieren. Tatsächlich deutet dies darauf hin, dass die Kontrollpunkte bei der Differenzierung von T-Zellen bei Leukämien unter hyperaktivem JAK STAT-Signal nicht funktionieren. Eine der Schlüsselfragen in diesem Zusammenhang ist, ob hyperaktives Stat5 nur vor Apoptose oder vor Apoptose und vermittelter T-Zellen Aktivierung schützt. Unsere Daten legen nahe, dass die Stat5-Hyperaktivierung den Apoptoseschutz und die T-Zell-Aktivierung vermittelt. Bemerkenswerterweise exprimieren unreife S5a- und S5b-T-Zellen die T-Zell-Rezeptor-Signalkomponente Cytokin-induzierbares SH2-haltiges Protein (Cish) und Granzym B (Gzmb) in hohen Konzentrationen im Gegensatz zum Wildtyp. Insgesamt sind in differenzierten S5a- und S5b-T-Zellen Gen-Sets, die verschiedener Subtypen von T-Zellen definieren, hochreguliert, obwohl sie sich in diesen Subtypen gegenseitig ausschließen. Mit anderen Worten, Signaturen, die verschiedene periphere T-Zell-Subtypen unterscheiden, werden über Stat5 aktiviert. Zusammengenommen zeigt diese Studie, dass die Aktivierung von Stat5 dazu führen kann, dass T-Zellen mit nicht geeigneten T-Zell-Rezeptoren den empfindlichen Selektionsprozess überleben, der zur T-Zell-Aktivierung führt. Darüber hinaus regulieren Zellen in einem kombinierten hyperaktiven Hintergrund von Rag2 - / - / Stat5 die Gene des T-Zellrezeptorweges hoch, was die Beteiligung von Stat5 im Gegensatz zur durch Selbstantigenbindung induzierten T-Zell-Aktivierung widerspiegelt. Die Datenanalyse und Generierung interaktiver Datenexplorationswerkzeuge in dieser Arbeit bietet eine wertvolle Grundlage für weitere Studien zur Untersuchung der Stat5-Hyperaktivierung während der T-Zell-Differenzierung und zur Behandlung von JAK STAT-vermittelten malignen Erkrankungen. Zukünftige Studien, die auf den in dieser Arbeit vorgestellten Forschungsergebnissen basieren, werden zu einem besseren Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen führen und möglicherweise die therapeutischen Strategien verbessern. Abstract Signal transducer and activator of transcription 5 (Stat5) are two closely related proteins (Stat5a and Stat5b) that play important roles in hematopoietic differentiation, proliferation and survival. In humans, the transcription factor STAT5B is constitutively activated in a wide range of hematopoietic malignancies. A hyper-active mutation in human STAT5B, hSTAT5bH642H, is recurrently found in patients suffering from lymphoma/leukemia. Despite being a target of major interest for therapeutic strategies and scientific studies, there is still a lot to learn about its roles in hematopoiesis and leukemogenesis. This study aims to address the impact of two hyperactive gain of function mutations in transgenic mice: Stat5aS710F and hSTAT5BN642H. The gain of function mutations Stat5aS710F (S5a) and Stat5bN642H (S5b) produce lethal thymomes that contain undifferentiated and differentiated T cells. Interestingly, both mutations are able to induce thymomes in Rag2-/-genetic background (referred to as R2S5a and R2S5b) - an eye-opening phenomenon since T cells in Rag2 deficient mice are stalled in an undifferentiated state because the required V(D)J recombination cannot be accomplished. The main questions in this thesis are (1) to understand howStat5 hyper-activation can cause disease, (2) identify the differences between hyper-activation of Stat5a and Stat5b, (3) see whether R2S5a and R2S5b cells resemble real T cells. Finally, (4) this data-set provides a resource to look at wildtype T cell differentiation which has to date not been published. To address these questions, we used an RNA-seq approach, where I performed a bioinformatics analysis including RNA-seq data analysis (sample quality assessment, differential expression analysis, gene ontology analysis, gene set enrichment analysis), generation of data exploration tools and interpretation of results. In this work I present the analysis of RNA-Seq data from different stages of T cell differentiation in different genotypic conditions(wildtype, Stat5aS710F, Stat5bN642H, Rag2-/-; Stat5aS710F, Rag2-/-;Stat5bN642H; Rag2-/-), the definition of new gene sets that follow a pattern along wildtype but not Rag2-/-; Stat5aS710For Rag2-/-; Stat5bN642HT cell differentiation and the conclusion that both hyperactive Stat5versions can bypass T cell differentiation checkpoints and create cells that express the characteristic cell surface markers CD4 and CD8. Effectively, this suggests that the checkpoints in T cell differentiation are dysfunctional in leukemias under hyper-active JAK STAT signaling. One of the key questions in this context is whether hyperactive Stat5 only protects from apoptosis or whether it protects from apoptosis and mediated T cell activation. Our data suggests that Stat5 hyper-activation mediates apoptosis protection and T cell activation. Strikingly, S5aand S5b immature T cells express the T cell receptor signaling component Cytokine-inducibleSH2-containing protein (Cish) and Granzyme B (Gzmb) at high levels as opposed to wildtype. Overall, in differentiated S5a and S5b T cells, gene sets defining different subtypes of T cells are upregulated although they are mutually exclusive in these subtypes. In other words, signatures that distinguishes various peripheral T cell subtypes are activated via Stat5.Taken together, this study shows that the activation of Stat5 may lead to T cells with inappropriate T cell receptors surviving the delicate selection process resulting in T cell activation. Furthermore, in a combined Rag2-/-/ Stat5 hyper-active background the cells upregulate T cell receptor pathway genes reflecting Stat5 involvement in contrast to self-antigen-binding induced T cell activation. The data analysis and generation of interactive data exploration tools in this thesis provides a valuable basis for further studies investigating Stat5 hyper-activation during T cell differentiation and addressing JAK STAT mediated malignancies. Future studies based on the research findings presented in this thesis will lead to a better understanding of underlying mechanisms and potentially improve therapeutic strategies submitted by Frank Ruge Masterarbeit Wien, FH Campus Wien 2020 |
