Aufreinigung und Kristallisationsversuche der Proteine Gorab und Sas6 der Spezies Drosophila zum Zweck der Strukturaufklärung

Autor: Iby, Lara
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2022
Předmět:
Popis: Ziel dieser Arbeit war es, die Proteine Gorab und Sas6 aus Drosophila melanogaster aufzureinigen und im Anschluss zu kristallisieren, um mehr über den strukturellen Charakter der Interaktion beider Proteine an den Zentriolen während der Zentriolen-Biogenese herauszufinden. Bezüglich des Zusammenbaus der Zentriolen wurden bereits etliche Faktoren ermittelt, die eine Rolle spielen. Der genaue molekulare Mechanismus konnte bisher jedoch noch nicht enthüllt werden. Es werden immer wieder neue Faktoren ermittelt, die in diesen Prozess eingreifen. Eines dieser Proteine in D.melanogaster war Gorab, das als bisher noch nicht charakterisierte Komponente der Zentriolen identifiziert wurde. In der vorliegenden Arbeit soll die Rolle Gorabs beim Zusammenbau der Zentriolen und seine Interaktion mit einem der wichtigsten Proteine des sogenannten ''Zentriolen-Wagenrads'', Sas6, beleuchten. Dafür werden Gorab und Sas6 co-exprimiert und aufgereinigt. Der daraus erhaltene Proteinkomplex soll dazu dienen, Kristallisationsverusche anzusetzen, um mithilfe der Protein-Kristalle mithilfe der Röntgenstrukturanalyse die Struktur aufzuklären. Das soll Einblick in die strukturellen Komponenten der Interaktion zwischen Gorab und Sas6 bieten. Das Endziel besteht darin, den molekularen Mechanismus am äußeren Rand des Wagenrads wahrend dem Zusammenbau der Zentriolen aufzuklären, sowie die genauen Aminosäurensequenzen zu definieren, die in die Interaktion involviert sind. Im Zuge dieser Arbeit wurden Abschnitte der Proteine Gorab und Sas6 erfolgreich aufgereinigt und jeweils Kristalle bei Raumtemperatur und 4°C angesetzt. Bisher blieb eine Bildung von Proteinkristallen jedoch aus. Daher konnte keine Röntgenstrukturanalyse zur Strukturbestimmung durchgeführt werden. Das Hauptaugenmerk liegt daher auf dem Aufreinigungsprozess der Proteine. The aim of this study is the purification and subsequent crystallization of the proteins Gorab and Sas6 derived from Drosophila melanogaster to explore the structural details of their interaction at the centriole cartwheel during centriole biogenesis. Regarding the centriole assembly, multiple essential components have already been identified, but the exact molecular mechanism have not yet been fully revealed. Frequently, new factors have been described which affect the process of centriole biogenesis. In this context, protein Gorab in D.melanogaster was newly identified as an uncharacterized centriolar component. The purpose of this work is to dissect the role of Gorab during centriole assembly and to describe its interaction with the main cartwheel protein Sas6. For this, Gorab and Sas6 are co-expressed and purified. The obtained protein complex is then used to set up crystallization trials for structure determination using X-ray crystallography. This will provide insights into the structural components of the interaction between the two structural components, Sas6 and Gorab. The ultimate aim is to define the molecular mechanism on the outer edge of the centriole cartwheel during centriole assembly between Gorab and Sas6 and to identify the exact amino acid sequences of both proteins involved in this process. During this work, some truncations of Gorab and of Sas6 involved in the interaction were successfully purified and crystal plates were set up at room temperature and at 4°C. Up to now, no crystals have been obtained yet. Therefore, structure determination via X-ray crystallography was not conducted. The focus of this work lies on the purification of the proteins.
Databáze: OpenAIRE
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