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Hintergrund: Die Grundlage des Lebens ist die DNA-Synthese. Um die DNA-Synthese und dadurch das Wachstum und die Aktivität eines beliebigen Organismus nachweisen zu können, wurden in den letzten Jahren viele verschiedene Ansätze entwickelt. Keines dieser Verfahren ist jedoch optimal für den Nachweis von neu synthetisierten Nukleinsäuren geeignet, da entweder der Zielorganismus dadurch geschädigt wird oder das Verfahren sehr zeitaufwändig ist. Fragestellung: Ziel der Studie war es zu untersuchen, ob es möglich ist, den Einbau stabiler Isotope in eine Nukleinsäure mittels Nanoporensequenzierung nachzuweisen. Dies würde einen direkten, fehlerreduzierten und qualitativ besseren Nachweis jeder Art von Organismus und vor allem nicht kultivierbarer Mikroorganismen in sogenannten Stable-Isotope-Probing (SIP)-Ansätzen ermöglichen. Methoden: Um zu überprüfen, ob es eine Änderung im Ionenstromsignal an einer Sequenzierungspore aufgrund des Einbaus von stabilen Isotopen in Nukleinsäuren gibt, müssen DNA-Fragmente erzeugt werden, die dann einer Oxford Nanopore Technologies (ONT) Sequenzierung unterzogen werden. Hierfür wurde in einem ersten Schritt das 16S rRNA Gen des Bakteriums Nitrosomonas europaea amplifiziert und anschließend wurden in einer zweiten PCR die stabilen Isotope 13-C und 15-N in die Nukleinsäure eingebaut. Nach der Sequenzierung wurde das Signal mit einem unmarkierten und einem 5-Brom-2'- desoxyuridin-5'-triphosphat (BrdUTP) markierten DNA-Fragment verglichen. Ergebnisse: Aus der Studie kann nicht eindeutig geschlossen werden, ob der Einbau von den stabilen Isotopen 13-C und 15-N in eine Nukleinsäure zu einer ausreichenden und eindeutigen Änderung im Ionenstromsignal an einer Nanopore während ONT Sequenzierung führt. Diskussion: Im Zuge dieser Studie konnte nicht mit Sicherheit festgestellt werden ob mit stabilen Isotopen markierte Nukleinsäuren eindeutig von unmarkierten mittels Nanoporensequenzierung unterschieden werden können. Jedoch wurde ausschließlich mit den stabilen Isotopen 13-C und 15-N markiert. Möglicherweise würde eine zusätzliche Markierung mit den stabilen Isotopen 2-H und 18-O der Nukleinsäure ein eindeutigeres Ergebnis erzielen. Weiters könnten auch sensitivere Nanoporen und Datenanalyseprogramme zu einem deutlicheren Unterschied im Signal führen. Dies müsste in weiteren Studien untersucht werden. Background: The fundament of life is DNA synthesis. In order to be able to detect DNA synthesis and subsequently growth and activity of any organism, many different approaches have been developed in recent years. However, none of these methods is optimal for the detection of newly synthesized nucleic acids, as they damage the target organism or the approach is very time-consuming. Research questions: The aim of the study was to investigate if it is possible to detect the incorporation of stable isotopes in a nucleic acid using nanopore sequencing. This would enable a direct, error reduced and qualitatively better detection of any biological entity and above all uncultivable microorganism in so called stable isotope probing (SIP) approaches. Methods: To check if there is a change in the ion current signal at a sequencing pore due to the incorporation of stable isotopes into nucleic acids, DNA fragments must be generated, which then will be subjected to Oxford Nanopore Technologies (ONT) sequencing. For this purpose, the 16S rRNA gene of the bacterium Nitrosomonas europaea was amplified in a first step and then the stable isotopes 13-C and 15-N were incorporated into the nucleic acid in a second PCR. After sequencing, the signal was compared with an unlabeled and a 5-bromo-2'-deoxyuridine 5'-triphosphate (BrdUTP) labeled DNA fragment. Results: From the study, it cannot be concluded distinctly whether incorporation of the stable isotopes 13-C and 15-N into a nucleic acid result in a sufficient and distinct change in the ion current signal at a nanopore during ONT sequencing. Discussion: In the course of this study, it could not be determined with certainty whether nucleic acids labeled with stable isotopes can be distinctly discriminated from unlabeled ones by means of nanopore sequencing. However, only the stable isotopes 13-C and 15- N were used for labeling. It is possible that additional labeling with the stable isotopes 2-H and 18-O of the nucleic acid would yield a more distinct result. Furthermore, more sensitive nanopores and data analysis programs could also lead to a more distinct difference in signal. This would have to be investigated in further studies. |
