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Die Leishmaniose ist eine parasitäre zoonotische Infektionskrankheit, die jährlich etwa 500.000 Menschen in tropischen und subtropischen Regionen befällt. Die Infektion kann zu einer Vielzahl von Symptomen und Krankheitsverläufen führen, die im schlimmsten Fall bis zum Tod führen können. Die Krankheit wird über die Sandfliege, einen Insektenvektor, übertragen und wird von Protozoen, den Leishmanien, verursacht. Leishmanien haben einen digenen Lebenszyklus. Im Verdauungstrakt des Insektenvektors befinden sie sich in ihrer promastigoten Form, innerhalb der Säugetier-Wirtsmakrophagen existieren sie in ihrer amastigoten Form. Die Amastigoten leben innerhalb des Phagolysosoms der Wirtsmakrophagen und daher ist eine vollständige, vom Makrophagen unabhängige Charakterisierung bezüglich enzymatischer Aktivitäten sowie Wirkstoffsensitivitäten nicht möglich. Der natürliche Lebensraum von Promastigoten im Darm der Sandfliege unterscheidet sich vom natürlichen Lebensraum der Amastigoten im Makrophagen-Phagolysosom hinsichtlich pH-Wert, Nährstoffverfügbarkeit sowie Temperatur. Um diese Parameter unabhängig von den Wirtsmakrophagen zu untersuchen, ist die Kultivierung von axenischen Amastigoten notwendig. Ziel dieser Studie war es daher, eine stabile Kultur von Leishmania tarentolae axenischen Amastigoten zu etablieren und die Aktivität verschiedener antileishmanialer Endoperoxide in beiden Lebensstadien zu vergleichen. Die Verwendung von bereits publizierten Protokollen, welche für die Transformation von anderen Leishmanienstämmen verwendet wurden, führte zu keinen befriedigenden Ergebnissen. Daher wurde die in vitro Transformation hinsichtlich pH-Wert, Medientyp und Medienzusammensetzung (FCS-Gehalt), Inkubationstemperatur und verschiedenen Belüftungsmethoden optimiert. Ziel war es, eine optimale Transformation von Promastigoten zu axenischen Amastigoten mit einem angemessenen Zellwachstum zu erreichen. Der Transformationsprozess wurde durch Zellzählung, morphometrische Messungen sowie der Fähigkeit, von axenischen Amastigoten zu Promastigoten zu redifferenzieren, charakterisiert. Eine optimale Transformation sowie eine maximale Ausbeute wurde unter Verwendung von Schneider‘s-Medium bei pH 4,5, kultiviert bei 32ºC unter Verwendung einer Standkultur erhalten. Beide Leishmanien-Lebensstadien wurden auf ihre Wirkstoffsensitivität unter Verwendung eines Resazurin- und eines MTT-Viabilitäts-Tests untersucht. Wir konnten zeigen, dass sowohl die Leishmania tarentolae Promastigoten als auch die Leishmania tarentolae axenischen Amastigoten ähnliche Sensitivitäten gegenüber den getesteten Endoperoxiden und Referenzsubstanzen aufwiesen. Diese Ergebnisse zeigen, dass axenische Amastigoten von Leishmania tarentolae ein interessantes Werkzeug sind, um die Arzneimittelsensitivität von intrazellulären Amastigoten aus pathogenen Leishmanien in Säugetier-Makrophagen zu verstehen. Leishmaniasis is a parasitic zoonotic disease which infects around 500,000 people annually in tropical and subtropical regions. The infection can lead to a variety of disease progressions, which, in the worst case, can even lead to death. The disease is transmitted via an insect vector, the sand flies and is caused by protozoal parasites. Leishmania follow a digenic life cycle. Inside of the insect vector they exist in a promastigote form and inside of the mammalian host they exist in an amastigote form. The amastigotes reside inside of the macrophages’ phagolysosome. Therefore, a full characterization regarding enzymatic activities as well as drug sensitivities independent from the macrophage is difficult. The natural habitat of promastigotes in the gut of the sand fly differs from the natural habitat of amastigotes in the phagolysosomes of macrophages with regards to pH, nutrient availability as well as temperature. In order to study these parameters independently from the host macrophages, the cultivation of axenic amastigotes is necessary. Therefore, the aim of this study was to generate a stable culture of Leishmania tarentolae axenic amastigotes and to compare the activity of different antileishmanial endoperoxides in both life stages. The use of standard protocols, used for the transformation of pathogenic Leishmania species did not lead to satisfying results. Therefore, the in vitro transformation was optimized with regards to pH, medium type and composition (FCS content), incubation temperature and different aeration methods. The goal was to achieve an optimal transformation from promastigotes to axenic amastigotes with a reasonable amount of cell growth. The transformation process was characterized by cell counting, morphometric measurements as well as the ability to redifferentiate back from axenic amastigotes to promastigotes. The optimal transformation as well as a maximum yield was obtained in Schneider’s medium at pH 4.5, cultivated at 32 °C using a standing culture. Both Leishmania life stages were tested for their drug sensitivity using a resazurin and an MTT viability assay. We showed that both, the Leishmania tarentolae promastigotes and the Leishmania tarentolae axenic amastigotes, had similar drug sensitivities against the tested endoperoxides as well as the tested reference substances. The obtained results show that axenic amastigotes of Leishmania tarentolae are an interesting tool to understand the drug sensitivity of intracellular amastigotes from pathogenic Leishmania in mammalian host macrophages. vorgelegt von: Matthias Tonner Auch als Printexemplar in der Bibliothek verfügbar Wien, FH Campus Wien, Masterarb., 2018 |
