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Zirkulierende Tumorzellen (CTC) sind mit einer schlechteren Überlebensrate von Krebspatienten assoziiert und können daher für Therapieentscheidungen und therapeutische Überwachung verwendet werden. Der Nachweis von CTC aus Vollblut erfordert jedoch eine schnelle Verarbeitung. Eine CTC-Analyse aus kryokonservierten Blutproben würde eine Analyse zu einem späteren Zeitpunkt ermöglichen und dieses Problem beheben. Es ist allerdings unbekannt, wie sich eine Kryokonservierung auf die Nachweisrate, die Isolationseffizienz und die DNA Qualität der isolierten CTCs auswirkt. Um diese Fragen zu beantworten, wurden zwei weit verbreitete Systeme, das Parsortix- und das CellSearch-System, zur Detektion und Isolierung von Tumorzellen miteinander verglichen. Das Parsortix-System beruht auf der Anreicherung von Tumorzellen aus frischem EDTA-Blut aufgrund ihrer Größe und Verformbarkeit. Das CellSearch-System arbeitet dagegen mit frischem, aber fixierten Vollblut und reichert Tumorzellen mittels des epithelialen Zelladhäsionsmoleküls (EpCAM) auf der Oberfläche der CTCs an. Um zunächst die CTC-Detektionsrate in Patienten zu bestimmen, wurden kryokonservierte Blutproben von Patienten mit metastatischem nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom sowohl mit dem CellSearch als auch mit dem Parsortix-System untersucht. Die detektierten CTCs der kryokonservierten Blutproben wurden durch Mikromanipulation isoliert und deren Genom amplifiziert. Anschließend wurde eine PCR-basierte Qualitätskontrolle der isolierten CTCs durchgeführt. Zur Bestimmung der Sensitivität von kryokonservierten Blutproben wurden spike-in Experimente mit Tumorzelllinien mit beiden Systemen durchgeführt. Während mit dem CellSearch-System gute Ergebnisse erzielt werden konnten, wurden im Parsortix-Workflow einige Schritte identifiziert, welche modifiziert werden sollten. Zudem wurden Haftobjektträger als zusätzliche Fixierungsmöglichkeit zu den Zytospin-Objektträgern in Betracht gezogen, um zu ermitteln ob diese nach der Zellernte mit dem Parsortix-Gerät verwendet werden könnten. Circulating tumour cells (CTC) are associated with a poorer survival rate of cancer patients and can therefore be used for therapy decisions and therapeutic monitoring. However, the detection of CTCs in whole blood requires fast processing. CTC analysis from cryopreserved blood samples and analysis at a later stage would alleviate this problem. Unfortunately, it is unknown how cryopreservation affects the detection rate, isolation efficiency and DNA quality of the isolated CTCs. In order to answer these questions, two commonly used systems, the Parsortix and the CellSearch system for the detection and isolation of tumour cells were compared. The Parsortix system enriches tumour cells from fresh EDTA blood based on their size and deformability. In contrast, the CellSearch system operates with fresh, fixed whole blood and enriches tumour cells based on the expression of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) on their surface of the CTCs. First, to determine the CTC-detection rate in patient samples, cryopreserved blood samples from patients with metastatic non-small-cell lung carcinoma were processed in parallel on CellSearch and Parsortix systems. In case CTCs were detected, they were isolated by micromanipulation and their genome was globally amplified. Finally, the quality of the amplified single cell genome was assessed with a PCR-based quality control. To determine the sensitivity of both CTC-detection methods, tumour cell lines were spiked into cryopreserved blood samples and processed in parallel with the CellSearch and Parsortix systems. While the recovery rate with the CellSearch system was in general satisfying, several steps for optimization were identified and tested in the Parsortix workflow. In addition, adhesive slides were explored as an alternative means of cell fixation after cell harvesting instead of cytospin slides. Thomas Schamberger Auch als Printexemplar in der Bibliothek verfügbar Masterarbeit Wien, FH Campus Wien 2020 |
