Development of Method for knock-out and knock-in techniques for pathogenic Bacillus cereus
| Autor: | Zajac, Benjamin |
|---|---|
| Jazyk: | němčina |
| Rok vydání: | 2020 |
| Předmět: |
response regular region
Wachstums- und Amylaseexpressions-Verhalten growth and amylase expression behavior Bacillus cereus amylase homologue Konstruktion neuer CRISPR/Cas9 Vektoren Amylase Homolog construction of new CRISPR / Cas9 vectors CRISPR/Cas9 System CRISPR / Cas 9 system pCER270 virulence plasmid pCER270-Virulenzplasmid response regular-Region |
| Popis: | Die genetische Veränderung genomischer Erbinformation von klinischen und industriell relevanten Bacillus cereus Stämmen gestaltet sich bisweilen äußerts aufwendig und ist oftmals von wenig Erfolg gekrönt. Da die genetische Manipulation von gDNA mitunter eines der wichtigsten Werkzeuge für Molekularbiologen für diverse Experimente ist, ist die Verbesserung der Zuverlässigkeit dieser Methoden große Bedeutung beizumessen. In dieser Arbeit wurde unter Zuhilfenahme einer Elektroporationsmethode ein CRISPR/Cas9 System erprobt. Die Konstruktion neuer CRISPR/Cas9 Vektoren ist zeitaufwändig, jedoch überzeugen die Plasmide durch Präzision, Effizienz und durch einfache Handhabung. Leider konnte die Restriktions-Modifikationsbarriere nicht zuverlässig durch Modifikation des Methyllierungsmusters der Plasmide umgangen werden. Das Genom Editierungs System ist erfolgreich etabliert und deletiert die response regular-Region auf dem Megavirulenzplasmid in der plasmidären B. cereus DNA. Es ist anscheinend gelungen ein Gen auf dem pCER270-Virulenzplasmid zu löschen, obgleich aktuell die Transformationsraten und Transformationseffizienzen mit B. cereus Zellen verbesserungswürdig sind. Im zweiten Teil des Projekts, der sich mit einer einfacheren und günstigeren Methode zur Erkennung von erfolgreichen Knock-in Experimenten in B. cereus beschäftigt, wurde das im B. cereus vorhandene Amylase Homolog untersucht. Vier Versuchsaufbauten zeigten das Wachstums- und Amylaseexpressions-Verhalten. In B. cereus konnte durch die Versuche keine Amylaseaktivität nachgewiesen werden. Die Anwendung des Amylase-homologes in B. cereus wäre ein vielversprechender Markergen-Kandidat für künftige Knock-in Experimente, falls sich das Gen biotechnologisch aktivieren lies. Genetic modification of clinically or industrially relevant Bacillus cereus strains is extremely complex and often not (very) successful. Since the genetic manipulation of gDNA is one of the most important tools for molecular biologists for various experiments, the improvement of the reliability of these methods is very important. In this work an CRISPR / Cas 9 system was tested using an electroporation method. The construction of new CRISPR / Cas9 vectors is time-consuming, however the plasmids impress with their precision, efficiency as well as their simple handling. Unfortunately, the restriction-modification barrier could not be reliably circumvented by modifying the methylation pattern of the plasmids. The genome editing system has been successfully established and deletes the response regular region in the genomic B. cereus DNA. Apparently, a gene on the pCER270 virulence plasmid has been successfully deleted., although the transformation rates and transformation efficiencies with B. cereus cells are currently in need of improvement. In the second part of the project, which deals with a simpler and cheaper method for recognizing successful knock-in experiments in B. cereus, the amylase homologue present in B. cereus was examined. Four experimental setups showed the growth and amylase expression behavior. In B. cereus, no amylase activity could be detected by the experiments. The use of the amylase homolog in B. cereus would be a promising marker gene candidate for future knock-in experiments if the gene could be actively expressed. |
| Databáze: | OpenAIRE |
| Externí odkaz: |
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