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Lungenkrankheiten sind weltweit verbreitet. Herkömmliche Diagnoseverfahren sind zeitintensiv und aufwendig zumal sie eine Reihe von verschiedenartigen Untersuchungen umfassen. Ein neuer Ansatzpunkt zur Diagnose ist die Untersuchung von krankheitsspezifischen Veränderungen im Methylierungsmuster der zirkulierenden zellfreien DNA. Potentielle methylierungsspezifische Biomarker können zur minimal invasiven Diagnostik verwendet werden, da diese Veränderungen häufig sowohl im betroffenen Gewebe als auch im Blutserum übereinstimmen. In unserer Studie wurden die Methylierungsmuster in Lungengewebe und Serum von Patienten mit chronisch obstruktiver Lungenkrankheit (COPD), idiopathischer Lungenfibrose (IPF), Lungenkrebs sowie gesunden Personen untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit vorhergehender Microarray-Analysen wurden Gensequenzen mit veränderter DNA Methylierung in den oberhalb erwähnten Krankheitsindikationen untersucht und gefunden. Für diese Genregionen wurden für die Verwendung von Methylierungssensitiven Restriktionsenzymen (MSRE) entsprechend passende Primer designt, um den Methylierungsstatus der Lungengewebsproben auch mittels MSRE-qPCR zu analysieren. Basierend auf der Analyse der Eigenschaften aller Assays (n=222), umfasst der durchschnittliche Assay eine PCR-Produktlänge von 100 bp mit 2 MSRE cut sites und hat eine PCR Effizienz von 95-100%. Die aufgrund der Microarray Analysen erhaltenen Daten wurden mittels Hochdurchsatz-qPCR mit den neu designten Primer validiert und bestätigt und eine Reihe von Faktoren identifiziert, die einen Einfluss auf eine erfolgreiche Validierung haben. Faktoren, die die größte Auswirkung haben, sind: 1) qPCR-fold change (p-Wert=5.80e-22), 2) microarray-fold change (p-Wert=2.29e-09), 3) AUC-value des microarray (p-Wert=1.26e-06). Neben der Validierung der Lungengewebsproben wurden die erfolgversprechensten Assays auch erfolgreich für eine DNA-Methylierungsmarker-Validierung in Seren von Patienten mit unterschiedlichen Lungenerkrankungen eingesetzt. Anhand der Analyse von 16 Serum-Replikaten konnte u.a. nachgewiesen werden, dass die neu entwickelten Protokolle für eine multiplex MSRE-basierende qPCR aus Serum eine hohe Reproduzierbarkeit (RHO=0.69 (+/- 0.158)) aufweisen. Pulmonary diseases are common health issues worldwide. The conventional diagnostic procedure is a long and elaborate process, which involves several tests. A new diagnostic approach would be the screening for disease-specific methylation alterations of cell-free DNA. Potential, methylation specific biomarker with consistent methylation pattern in lung tissue and serum can be utilized for minimal invasive diagnosis. Our objective was therefore to analyse the methylation patterns of lung tissue and serum of lung cancer patients, patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and patients suffering from idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) and to compare them to healthy probands. Previous microarray analyses in lung tissue of patients suffering from the diseases described above revealed gene sequences with altered DNA methylation. Accordingly gene region-specific primers were designed for the application of methylation sensitive restriction enzyme (MSRE)-based qPCR in order to analyse the methylation status of the given lung tissue samples. Based on the analysis of characteristics of all assays (n=222), the average assay contained a PCR product with 100 bp length and 2 MSRE cut site and showed a PCR efficency of 95-100%. To validate the results, obtained by microarray analysis, via high throughput qPCR with the newly designed primers, optimal assay conditions had first to be determined before the qPCR validation was then performed on both lung tissue and serum samples. Successful qPCR validation is influenced by several major factors such as: 1) qPCR-fold change (p-value=5.80e-22), 2) microarray-fold change (p-value=2.29e-09), and 3) AUC-value of microarray (p-value=1.26e-06). After optimising the protocol and validation in lung biobsy samples, the most promising qPCR assays were revalidated with clinical serum samples. Using 16 serum replicates, a high reproducibility (RHO=0.69 (+/- 0.158)) was detected for validation of assays, when applying our established multiplex MSRE-based qPCR protocol. vorgelegt von: Ulrike Kegler Molecular Biotechnology Wien, FH Campus Wien, Masterarb., 2015 |
