Modifying hydrolases in order to improve degradation of mycotoxins : question: identification, characterization and production of hydrolytic enzymes by directed evolution
| Autor: | Kastner, Florian |
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| Jazyk: | němčina |
| Rok vydání: | 2013 |
| Předmět: |
Mykotoxin-detoxification
Hydrolasen Directed Evolution Modification of Enzumes Hydrolases Site Directed Mutagenese acid pH-range Enzyme und deren Modifikation Mykotoxin-Detoxifikation Temperaturstabilität Enzymes Site Directed Mutagenesis saurer pH-Bereich Site Saturation Mutagenesis Site Saturation Mutagenese Temperature stability |
| Popis: | Mykotoxine sind eine Gruppe von strukturell heterogenen Sekundärmetaboliten, welche von weltweit vorkommenden Schimmelpilzen gebildet werden. Eines dieser Mykotoxine stellt in der Lebens- und Futtermittelproduktion sowie der Viehzucht ein nicht zu unterschätzendes Problem dar. Seine Detoxifikation durch eine Hydrolase ist ein vielversprechender Weg zur Verringerung der Belastung in Lebens- und Futtermitteln. Aufgrund seiner Empfindlichkeit gegenüber höheren Temperaturen und saurem pH scheint der kommerzielle Einsatz dieses Enzyms allerdings zurzeit wenig praktikabel. In der vorliegenden Arbeit wurde das Gen mittels Directed Evolution, Site Directed- und Site Saturation Mutagenese mutiert, und das Enzym konstitutiv im Wirt exprimiert. Mittels Hochdurchsatzscreening wurde nach Mutanten mit verbesserten Eigenschaften gesucht. Diese Varianten wurden im Labormaßstab produziert, chromatographisch gereinigt und anschließend biochemisch charakterisiert. Diese Untersuchungen geben Aufschluss über die Auswirkungen von Temperatur und pH-Wert auf die Aktivität des Enzyms und Erkenntnisse über katalytisch wichtige Aminosäuren des aktiven Zentrums. Weiters wurden steady-state Messungen durchgeführt, um die kinetischen Konstanten (Km und kcat) zu ermitteln. Während der Charakterisierung konnten zwei signifikant thermostabilere Varianten identifiziert werden. Diese zeigten bei 55°C die 10- bzw. 5-fach höhere Thermostabilität im Vergleich zum Wild-typ. Durch die gewonnenen Informationen könnten die Enzyme die Basis für weitere Untersuchungen darstellen. Mycotoxins are a group of structurally diverse secondary metabolites, which are formed by fungi occurring worldwide. One of these mycotoxins represents in the food and feed production and animal husbandry a not to be underestimated problem. Its detoxification by a hydrolase is a promising way to reduce the burden in food and feed. Due to its sensitivity to higher temperatures and acidic pH the commercial use of this enzyme, however, seems impractical at present. In the present work, the gene was mutated using directed evolution, site-directed and site-saturation mutagenesis, and the enzyme was constitutively expressed in a host. It was searched for mutants with improved properties by high-throughput screening. The variants were produced in laboratory scale, purified by chromatography and subsequently characterized biochemically. These studies provide information on the effects of temperature and pH on the activity of the enzyme and insights into catalytically important amino acids in the active site. Further, steady-state measurements were performed to determine the kinetic constants (Km and kcat). During the characterization of two thermostable significant variations were identified. They showed at 55° C the 10 - and 5-fold higher thermal stability compared to the wild-type. Due to the obtained information, the enzymes could form the basis for further investigations. vorgelegt von: Florian Kastner Masterarbeit Wien, FH Campus Wien 2013 |
| Databáze: | OpenAIRE |
| Externí odkaz: |
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