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Developmental and Epileptic Encephalopathies (DEEs) sind schwere, heterogene Entwicklungsstörungen, die sich durch ein frühes Eintrittsalter, eine Verzögerung der neurologischen Entwicklung und therapie- und medikamentenresistente Anfälle auszeichnen. Durch die technologischen Fortschritte der letzten Jahre wurden Hochdurchsatz-Sequenzierungstechniken entwickelt, um die Entdeckung von pathogenen Varianten zu unterstützen, die an der komplexen Genetik der DEEs beteiligt sind. Obwohl die meisten klinisch genutzten Sequenzierungstechniken auf der DNA basieren, wird in jüngster Zeit vermehrt die Transkriptomik im klinischen Umfeld eingesetzt, da sie die Interpretation von nicht-kodierenden Varianten ermöglicht. In unserer DEE-Kohorte konnten wir zwei neue Varianten von unbekannter Bedeutung in GRIA3 und SMARCA1 identifizieren und eine de novo Strukturvariante in RPS6KC1 nachweisen. Darüber hinaus wurden durch RNA-Sequenzierung an 20 von Patienten stammenden Fibroblastenlinien 38 potenziell pathogene Varianten gefunden. Der Vergleich der verschiedenen Sequenzierungstechniken führte zu der Schlussfolgerung, dass eine größere Kohorte und die zusätzliche Sequenzierung von nahen Verwandten die Entdeckung pathogener Varianten erheblich erleichtert. Auch wenn die RNA-Sequenzierung ein vielversprechendes Werkzeug für die Entdeckung von genetischen Varianten ist, müssen die derzeit verfügbaren Analysepipelines verbessert werden. Durch die kontinuierliche Suche nach neuen potenziellen Varianten wurden in drei nicht verwandten Familien, die von DEE betroffen sind, Mutationen im Gen FSD1L entdeckt. Um die Rolle von FSD1L bei DEE zu bestimmen, wurde ein CRISPR-vermitteltes Knockout-Modell erstellt. Nach der Bestätigung eines erfolgreichen Gen-Knockouts durch qPCR wollten wir zunächst den Phänotyp der erzeugten Klone untersuchen. Da ein signifikanter Adhäsionsverlust in den Knockout-Zellen festgestellt wurde, wollten wir versuchen, den Phänotyp des Knockout-Modells durch Überexpression von FSD1L zu retten. Die Nukleofektion führte zu einer hohen Zelltodrate, während die Transfektion zwar einen geringeren Zelltod, aber eine geringere Überexpressionseffizienz ergab. Darüber hinaus wurde ein vielversprechender FSD1L-Antikörper für Western Blots gefunden, der ursprünglich nur für die Immunhistochemie entwickelt worden war. Bei der Untersuchung des Einflusses von FSD1L auf mitotische Spindeln konnte kein signifikanter Unterschied zwischen Wildtyp- und Knockout-Zellen festgestellt werden. Obwohl die biologische Funktion und die Rolle von FSD1L bei DEE noch weitgehend unbekannt ist, wurde ein erfolgreiches Knockout-Modell validiert und ein Antikörper gefunden, der sich zur Identifizierung des Proteins eignet. Außerdem wurde ein signifikanter Unterschied in der Adhäsion durch das Fehlen von FSD1L nachgewiesen. Developmental and Epileptic Encephalopathies (DEEs) are severe heterogeneous developmental disorders characterized by early age of onset, neurodevelopmental delay and therapy- and drug-resistant seizures. With the technological advances in the past years, high-throughput sequencing techniques have been developed to aid in the discovery of pathogenic variants involved in the complex genetics of DEEs. Even though most clinically used sequencing techniques are based on DNA, more recently the use of transcriptomics in a clinical setting has increased since it allows the interpretation of non-coding variants. In our DEE cohort, we identified two new variants of unknown significance in GRIA3 and SMARCA1 and proved a de novo structural variant in RPS6KC1. Moreover, by performing RNA-sequencing on 20 patient-derived fibroblast lines, 38 potentially pathogenic variants were found. The comparison of different sequencing techniques led to the conclusion that a larger cohort and additional sequencing of close relatives greatly facilitates pathogenic variant discovery. Even though RNA-sequencing is a promising tool for variant discovery, the currently available analysis pipelines need to be improved to increase efficiency. Through the continuous search for new potential variants, mutations in the gene FSD1L were discovered in three unrelated families affected by DEE. To determine the role of FSD1L in DEE, a CRISPR-mediated knockout model was created. After the confirmation of a successful gene knockout through qPCR, we first wanted to study the phenotype of the generated clones. The knockout clones showed a significant loss in, therefore we wanted to attempt a phenotype-rescue in the knockout model through FSD1L overexpression. Nucleofection resulted in a high cell death rate, while transfection showed decreased cell death but lower overexpression efficiency. Furthermore, a promising FSD1L antibody for western blots was found, which was originally only designed for immunohistochemistry. By investigating the influence of FSD1L on mitotic spindles, no significant difference between wildtype and knockout cells could be determined. Even though its biological function and the role of FSD1L in DEE remains mostly unknown, a successful knockout model was validated and an antibody for protein identification was found. Additionally, a significant difference in adhesion by the absence of FSD1L was proven. |
