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Bei Rhinoviren (RV) handelt es sich um kleine, einzelsträngige RNA Viren, welche sowohl die oberen als auch unteren Atemwege infizieren. Infektionen werden weltweit über das gesamte Jahr und somit unabhängig von Jahreszeiten verzeichnet (Jacobs et al. 2013). Durch die hohe Anzahl unterschiedlicher Serotypen ist bisher kein Vakzin erhältlich, welches gegen Infektion durch Rhinoviren schützt (Mclean 2015). Typ C Rhinoviren, eine erst in der letzten Dekade entdeckte Spezies, ist eine noch wenig erforschte Gruppe. Jedoch ist RV-C im Gegensatz zu den A-Typ (RV-A) und B-Typ (RV-B) Rhinoviren häufiger mit dem Auftreten von schwereren Symptomen der unteren Atemwege assoziiert, wie beispielsweise Bronchitis (Hao et al. 2012) und Asthmaanfällen (Bizzintino et al. 2011). Dies begründet sich vor allem durch effiziente Replikation bei 37°C, welche in den unteren Atemwegen vorherrschen, durch GC-reiche Regionen im RV-C Genom, wohingegen der optimale Temperaturbereich von Rhinoviren des Typs A und B bei 33°C bis 35°C liegt, welche in den Nasenhöhlen vorherrscht (Ashraf et al. 2013). Da sich die Kultivierung des Rhinovirus Typ C in Zellkultur zur Untersuchung von dessen Charakteristika als schwierig herausstellte (Bochkov & E. Gern 2012), wurde in dieser Masterarbeit eine Alternativmethode gewählt, um virale Partikel zu generieren. Anstatt den Virus in Zellkultur zu kultivieren, basiert unser Ansatz auf der Anwendung eines Expressionssystems in Insektenzellen, wodurch es gelingen sollte funktionale virale Strukturproteine des Rhinovirus C15 herzustellen. Diese sollten die Fähigkeit zur Selbst-Assemblierung besitzen und somit in der Lage sein, VLPs (virus like particles) zu bilden. VLPs weisen hierbei eine ähnliche Oberflächenstruktur wie der native Virus auf, enthalten aber im Gegensatz zu diesem keine virale Nukleinsäure (Zeltins 2013). Durch ihren potentiellen Nutzen als sichere und wirksame Vakzine wächst die Bedeutung von VLPs. (Monk & Mahdavi 2007) Als Ziel dieser Masterarbeit wurde die in-vitro Herstellung großer Mengen an virus-like-particles (VLPs) definiert, um die Kapsid Struktur mittels Cryo-Elektronen-Mikroskopie zu erforschen, die Interaktion mit dem schon identifizierten Rezeptor zu charakterisieren, sowie die Herstellung 3 neutralisierender Antikörper zu ermöglichen. Dafür wurden rekombinante Baculoviren hergestellt, welche nach Infektion von Hi5 oder Sf9 Insektenzellen die Strukturproteine von Rhinovirus C15 (VP0, VP1 and VP3) als Vorläuferform (P1) zusammen mit der viralen Protease 3CDpro produzieren. Letztere dient der Prozessierung des P1 Vorläufers in die individuellen Kapsid Proteine, welche durch Aneinanderlagerung intrazellulär VLPs bilden. (Zlotnick 1994). Aufgrund der Zytotoxizität von Wildtyp 3CDpro wurde eine abgeschwächte Version eingesetzt, worin das katalytisch aktive Cystein durch ein Serin ausgetauscht war. Nachweis der korrekten Prozessierung erfolgte mittels Westernblot Analyse unter Verwendung eines RV-C15 VP0-spezifischen polyklonalen Serums. Die bei 80S sedimentierenden VLPs wurden nach Freisetzung aus den Insektenzellen durch Gradientenzentrifugation von kleineren (langsamer sedimentierenden) zellulären Proteinen abgetrennt. Trotz verschiedenster Modifikation des Basisprotokolls war jedoch die Menge an VLPs in den entsprechenden Fraktionen des Saccharose-gradienten sehr gering. Zudem stellte sich gegen Ende der Arbeit heraus, dass höchstwahrscheinlich eine unkonventionelle Translations-Startstelle für den P1 precursor oberhalb des eigentlichen AUG Initiationscodons in etwa gleichem Ausmaß zur Expression eines etwas längeren P1 Proteins führte. Das daraus N-terminal verlängerte VP0 unterbindet voraussichtlich den geordneten Assemblierungsprozess, was in weiterer Konsequenz die niedrige Ausbeute an RV-C15 VLPs erklärt. Rhinoviruses are small, single stranded RNA viruses infecting the upper and lower respiratory system in humans (Jacobs et al. 2013). The virus is affecting the population worldwide, at almost all times throughout the year (Jacobs et al. 2013). Due to the high amount of different serotypes, a vaccination protecting against an adequate range of rhinoviruses is not available (Mclean 2015). Rhinoviruses C, a group discovered about a decade ago, is still relatively unexplored. However, in contrast to rhinovirus type A (RV-A) and B (RV-B) RV-C is commonly associated with the more severe symptoms of the infection like bronchitis (Hao et al. 2012) and asthma attacks (Bizzintino et al. 2011). It relates to the fact that the GC rich RV-C can efficiently replicate around 37°C prevailing in lower respiratory tract, while the optimal temperature range for classical A and B type RVs is 33°C to 35°C as in the nasal cavity (Ashraf et al. 2013). Due to difficulties to grow rhinovirus C in cell culture (Bochkov & E. Gern 2012) and study its characteristics, an alternative path to obtain the viral particles was attempted. Instead of cultivation of the virus in cell culture, our approach is based on an insect cell expression system, which should be able to produce functional structural proteins of the rhinovirus which have the ability to self-assemble and form virus like particles (VLP). VLPs have a similar, if not identical, surface structure compared to the native virus but do not contain the viruses nucleic acid (Zeltins 2013). Nowadays VLPs are becoming more important in the vaccine development because of their potential use as a safe and efficient vaccine. (Monk & Mahdavi 2007) Aim of this master thesis was to produce high amounts of the virus-like-particles (VLPs) in vitro, to analyze the capsid structure via cryo-electron microscopy, to characterize interactions with the identified receptor as well as to enable the production of neutralizing antibodies. Thus, recombinant baculoviruses producing structure proteins of rhinovirus C15 (VP0, VP1 and VP3) as precursor (P1) in Hi5 or Sf9 insect cells were generated. The P1 precursor is processed by the 3CDpro thus generating individual capsid proteins, resulting in the formation of VLPs via intracellular self-assembly 5 (Zlotnick 1994). Due to the cytotoxicity of the wildtype 3CDpro, the catalytically active cysteine was changed to a serine resulting in a less active version of the protease. Presence of the protein was confirmed via western blot analysis, whereas a RV-C15 VP0-specific polyclonal serum was used. After insect cell lysis, VLPs sedimenting at 80S were separated from smaller (slower sedimenting) cellular proteins via sucrose-gradient centrifugation. Despite modifications of the basic protocol, the amount of VLPs within the sucrose gradient fractions was not sufficient. In addition, at the end of this work we found that an unconventional translation initiation site for the P1 precursor upstream the AUG initiation codon might have led to an elongated P1 protein in the same amount. The resulting N-terminal elongated VP0 might inhibit the assembly process, thus resulting in the low amounts of generated RV-C15 VLPs. Wien, FH Campus Wien, Masterarb., 2017 |
