| Popis: |
Die Nicotinamidadenindinukleotidphosphat-Oxidase Isoform 2 ist ein Enzymsystem, welches reaktive Sauerstoffspezies herstellt und aufgrund dessen im Kontext zahlreicher pathologischer Zustände eine gewichtige Rolle spielt. Die beiden Untereinheiten p47phox und p22phox stellen mit ihrer Interaktion einen entscheidenden Schritt in der Aktivierung des Enzymkomplexes dar und sind somit geeignete Zielmoleküle für die therapeutische Behandlung von oxidativem Stress. Dementsprechend wurden „small-molecule“-Inhibitoren entwickelt, die das Potential besitzen, an die beiden SH3 Domänen des p47phox-Proteins zu binden. Dieser Ansatz nutzte die Fragment-basierteWirkstoffforschung und eine Verknüpfung monomerer Fragmente zu einem dimeren Molekül. Zehn verschiedene Varianten dieser dimeren Moleküle, die sich einzig in ihrer Linker- Struktur unterschieden, wurden mittels Oberflächen-Plasmon-Resonanz sowie Fluoreszenz- Polarisation auf ihr Bindungsvermögen zu den beiden SH3 Domänen von p47phox getestet. Die beiden wirksamsten dimeren Moleküle wiesen submikromolekulare Dissoziationskonstanten auf und wurden für thermodynamische Studien mit Hilfe von isothermer Titrationskalorimetrie ausgewählt. Hierbei offenbarten sich unterschiedliche Enthalpie- sowie Entropie-Beiträge der beiden Moleküle in ihrer Bindung zu p47phox. Beide hatten jedoch die erwartete Bindungs-Stöchiometrie von 1:1 zwischen einem dimeren Molekül und dem p47phox-Protein gemein. Dem gegenüber stand eine 2:1 Bindungs-Stöchiometrie zwischen dem einzelnen monomeren Fragment und p47phox. Analog zu dem Fragment führte die Bindung der dimeren Moleküle zu keiner kompakten Struktur der SH3 Domänen. Solch eine kompakte Struktur war hingegen bei der Bindung eines Peptids des physiologischen Bindungspartners, p22phox, mittels Kleinwinkelröntgenstreuung nachweisbar. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Bindung ausgewählter dimerer Moleküle zu den SH3 Domänen von p47phox validiert und anhand der gewählten Verknüpfung der monomeren Fragmente klassifiziert werden konnte. Die isotherme Titrationskalorimetrie konnte überdies das vermutete 1:1-Bindungsverhalten bestätigen und lieferte wichtige Ansatzpunkte für die nachfolgende Phase der Leitstruktur-Optimierung. The nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase isoform 2 (NOX2) is an enzyme complex, which produces reactive oxygen species and is linked to several pathological conditions. The interaction between its subunits p47phox and p22phox is essential for the activation of the enzyme complex, and thus suggested as potential target for therapeutic approaches towards oxidative stress. Dimeric small-molecule inhibitors binding to the tandem SH3 domain of p47phox were designed, arising from a fragment-based screen and subsequent fragment linking. Ten dimeric compounds with various linker structures were tested in their binding affinity to the tandem SH3 domain of p47phox by surface plasmon resonance and fluorescence polarization. The two most potent compounds showed submicromolar dissociation constants and were selected for thermodynamic studies using isothermal titration calorimetry. The two molecules differed in their enthalpic and entropic profile, but their supposed binding stoichiometry of 1:1 between a dimeric compound and the tandem SH3 domain was confirmed. This was consistent with a 2:1 binding stoichiometry of the original monomeric fragment. However, just as the fragment, the dimeric compounds did not induce a more compact structure of the tandem SH3 domain. Such a compact structure was seen for a peptide deriving from the physiological binding partner, p22phox, with the aid of small-angle X-ray scattering. In conclusion, binding of selected dimeric compounds to the tandem SH3 domain of p47phox could be validated and affinities determined as a function of the linking type. Isothermal titration calorimetry studies confirmed the expected binding mode and provided possible starting points for the prospective lead optimization phase. submitted by: Felix Peters Auch als Printexemplar in der Bibliothek verfügbar Masterarbeit Wien, FH Campus Wien 2021 |
