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In dieser Studie wird die funktionelle Rolle einer nicht-definierten Kinase in der Aktivierung und Proliferation in primären humanen CD4+ und CD8+ T-Zellen untersucht. T Zellen spielen eine wichtige Rolle in der adaptiven Immunantwort und sind daher ein potenzieller Angriffspunkt für die Inhibierung in T Zell-vermittelten Krankheiten. Frühere Experimente zeigen, dass T Zellen durch einen Kinase Inhibitor in ihrer Proliferation gehemmt werden. Es ist jedoch nicht bekannt, ob die Inhibierung T Zellen gänzlich hemmt, oder eine Polarisierung in einen regulatorischen Phänotyp induziert. Das Ziel dieser Studie war es zu ermitteln, ob CD4+ und CD8+ T Zellen, welche mit diesem Inhibitor gehemmt wurden, nach Restimulation ohne Inhibitor wieder in der Lage sind normal zu proliferieren. Des Weiteren wurde untersucht, ob die Inhibierung der Proliferation aufgrund einer Differenzierung in regulatorische T Zellen (Treg) verursacht wird. Daher wurden CD4+ T Zellen mit dem Inhibitor stimuliert und eine mögliche Differenzierung zu Treg anschließend mittels funktionellen Tests sowie der für Treg charakteristische Phänotyp CD25highCD127lowFOXP3+ mittels Durchflusszytometrie untersucht. Um nachzuweisen, ob der getestete Inhibitor die Kinase spezifisch inhibiert, wurde ein knock-down mittels shRNA- Lentivirus Transduktion in CD4+ T Zellen durchgeführt. Anschließend wurde die Proliferationsrate nach vier Tagen der Stimulierung mittels durchflusszytometrischer Analysen berechnet. Anhang einer real-time PCR wurde die Effizienz des Knock-downs ermittelt. Die Ergebnisse zeigen, dass sich restimulierte CD4+ und CD8+ T Zellen in Abwesenheit des Inhibitors erholen und nahezu vollständig wieder proliferieren. CD8+ T Zellen zeigen zusätzlich eine erhöhte Proliferationsrate nach erneuter Stimulierung ohne Inhibitor. Zusätzlich konnten wir bestätigen, dass der Inhibitor die Proliferation von CD4+ und CD8+ T Zellen hemmt. Weiters zeigte die Inhibierung der Kinase in CD4+ T Zellen keine Veränderung in der FOXP3 und CD39 Expression. Auch die funktionellen Analysen im Rahmen eines Co-Culture Assays bestätigen, dass die Inhibitor-bedingte Hemmung der Proliferation nicht durch die Differenzierung in regulatorische T Zellen verursacht wird. Die Ergebnisse zeigen, dass der shRNA-vermittelte knock-down nur eine geringfügige Inhibierung der Proliferation induziert. Auch die mRNA Expression des Zielgens war nicht verändert. Dies deutet darauf hin, dass der knock-down nicht erfolgreich war. Zusammenfassend konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass der Inhibitor eine Hemmung der T Zell Proliferation induziert, welche nicht durch Differenzierung in Treg induziert wird und auch wieder durch Entfernung des Inhibitors aufgehoben wird. Daraus folgt, dass diese Kinase einen funktionellen Einfluss auf die Aktivierung in T Zellen hat. Eine selektive Inhibierung von T-Zell Signalwegen stellt eine interessante Möglichkeit zur Immunsuppression in T Zell vermittelten Erkrankungen dar. This study focuses on the role of a not-defined kinase in the activation and proliferation in human CD4+ and CD8+ T cells. T cells play an important role in adaptive immune responses and thus act as a potential target to suppress signalling pathways in T cell-mediated diseases. Preceding experiments show that the kinase inhibitor supresses T cell proliferation. Although, it is still unknown whether the inhibitor suppresses T cells entirely or induces a polarization toward a regulatory T cell (Treg) phenotype. The aim of this study was to evaluate if CD4+ and CD8+ T cells, pretreated with the inhibitor, recover in proliferation. Moreover, it was investigated if the inhibitor induces differentiation into T regulatory cells. Hence, CD4+ T cells were stimulated in presence of the inhibitor. Then, a potential differentiation into Treg was evaluated by functional tests and by flow cytometry analyses of CD25highCD127lowFOXP3+ characterized Tregs. To verify specific inhibition of this kinase, a knock-down via shRNA-lentivirus transduction was conducted. Then, the proliferation rate was calculated after four days of stimulation via flow cytometric analyses. The efficiency of the knock-down was evaluated by real-time PCR. The results show, that restimulated CD4+ and CD8+ T cells in absence of the inhibitor recover in proliferation after four days of restimulation. In addition, CD8+ T cells even enhance in proliferation after restimulation in absence of the inhibitor. Moreover, we demonstrated that the inhibitor suppresses proliferation of CD4+ and CD8+ T cells. The inhibition of the kinase in CD4+ T cells indicate no shift in FOXP3 and CD39 expression. In addition, the functional analysis by co-culture assays demonstrated, that the suppressive effect of the inhibitor is not caused by differentiation into Tregs. Results of the knock-down show that the shRNA-mediated knock-down only induces a slightly inhibition in proliferation. Furthermore, mRNA of the target gene showed no change in expression. This indicates, that the knock-down was not successful. In summary, in this study we demonstrated that the inhibitor induces an inhibition of the proliferation in T cells, which is not induced by differentiation into Tregs. Moreover, the T cells recover in proliferation when the inhibitor was removed. Consequently, this kinase has a functional role in T cell activation. A selective inhibition of T cell signalling pathways could be an interesting target for immunosuppression. |
