| Přispěvatelé: |
Ζηκόπουλος, Κωνσταντίνος, Γεωργίου, Ιωάννης, Τζαβάρας, Θεόδωρος, Βρεκούσης, Θωμάς, Μπατιστάτου, Άννα, Σοφικίτης, Νικόλαος, Ναυρόζογλου, Ιορδάνης |
| Popis: |
Τα ρετρομεταθετά στοιχεία αποτελούν επαναλαμβανόμενες ακολουθίες DNA και απαντώνται σε πολλά αντίγραφα στο γένωμα όλων των οργανισμών. Λόγω της ικανότητάς του να μετακινούνται και να αυξάνουν τον αριθμό αντιγράφων τους, έχουν διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στη δομή, τη λειτουργία και την εξέλιξη του γενώματος των ευκαρυωτικών οργανισμών. Ωστόσο, από το σύνολο των ρετρομεταθετών στοιχείων, λόγω συσσώρευσης μεταλλάξεων, μόνο ένας μικρός αριθμός από αυτά έχει παραμείνει ενεργός. Γεγονότα ρετρομετάθεσης έχουν παρατηρηθεί σε γαμετικά κύτταρα, σε καρκινικά κύτταρα, σε νευρικά κύτταρα εγκεφάλου και σε πρώιμα στάδια εμβρυϊκής ανάπτυξης. Τα κύτταρα ελέγχουν την έκφραση των ρετρομεταθετών στοιχείων μέσω μηχανισμών, όπως η μεθυλίωση του DNA και ο μεταμεταγραφικός έλεγχος που ασκούν τα μικρά, μη-κωδικά μόρια RNAi, για να εξασφαλίζουν τη δομική και τη λειτουργική ακεραιότητα του γενώματός τους. Σκοπός της ερευνητικής εργασίας αποτέλεσε η μελέτη της παρουσίας των γεγονότων ρετρομετάθεσης στο εσωτερικό ώριμων σπερματοζωαρίων και η μελέτη του ρόλου των ρετρομεταθετών στοιχείων στη φυσιολογική πορεία της προεμφυτευτικής ανάπτυξης εμβρύων μυός. Ταυτόχρονα, μελετήθηκε η επίδραση της αναστολής του ενζύμου της ανάστροφης μεταγραφάσης στη γαμετογένεση και στην in vitro πρώιμη εμβρυϊκή ανάπτυξη. Για τη μελέτη των γεγονότων ρετρομετάθεσης χρησιμοποιήθηκαν πλασμιδιακοί φορείς που φέρουν κλωνοποιημένα τα ανθρώπινα ρετρομεταθετά στοιχεία LINE-1, τα ανθρώπινα ρετρομεταθετά στοιχεία HERVK-10 και τα ρετρομεταθετά στοιχεία του μυός, VL30. Τα υπό μελέτη στοιχεία φέρουν ενσωματωμένη ειδική κασέτα ανίχνευσης των γεγονότων ρετρομετάθεσης, η οποία στηρίζεται στην έκφραση της EGFP. Οι εξωγενείς πλασμιδιακοί φορείς δεσμεύονται αυθόρμητα από τα σπερματοζωάρια και ενσωματώνονται στο εσωτερικό τους, και μέσω in vitro γονιμοποίησης, μεταφέρονται παθητικά από τα σπερματοζωάρια στα ωάρια. Για τη μελέτη της αναστολής του ενζύμου της ανάστροφης μεταγραφάσης, χρησιμοποιήθηκαν οι αναστολείς Lamivudine και Nevirapine, οι οποίοι χορηγήθηκαν σε αρσενικούς και θηλυκούς μύες, για διάστημα 10 εβδομάδων. Προστέθηκαν επίσης στο καλλιεργητικό μέσο ανάπτυξης των εμβρύων και μελετήθηκε ο ρόλος τους στην φυσιολογική προεμφυτευτική πορεία των εμβρύων μυός. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν πως α. τα σπερματοζωάρια ενσωματώνουν τα εξωγενή ρετρομεταθετά στοιχεία και ευνοούν την παρουσία γεγονότων ρετρομετάθεσης β. τα σπερματοζωάρια μεταφέρουν τα εξωγενή ρετρομεταθετά στοιχεία στα ωάρια μέσω της γονιμοποίησης γ. η υπερέκφραση των ρετρομεταθετών στοιχείων επηρεάζει τη φυσιολογική πορεία της πρώιμης ανάπτυξης εμβρύων μυός δ. η αναστολή του ενζύμου της ανάστροφης μεταγραφάσης επηρεάζει τη φυσιολογική πορεία της σπερματογένεσης και της ωογένεσης, καθώς και τη φυσιολογική προεμφυτευτική ανάπτυξη εμβρύων μυός. Retroelements are a major type of genetic mobile elements which have played a crucial role in the genome structure, function and evolution, by relocating themselves from site to site in the genome. Despite their high distribution in the mammalian genomes, only a minority of them are still active as they have lost their capacity to retrotranspose, due to defective mutations and truncations. Active retroelement transcripts are present in male and female gametes, where they are typically regulated by methylation, non–coding RNAs and transcription factors. Retroelement control failure may exert negative effects on cellular function and proliferation. In the present study, we investigated the occurrence of de novo retrotransposition events in mouse spermatozoa, the potential transfer of these retroelements into the mouse oocyte during fertilization as well as their impact on the mouse preimplantation embryo development. Additionally, we studied the effect of reverse transcriptase inhibition in gametogenesis and early mouse embryonic development. In order to study the retrotransposition events, we used plasmid vectors containing the human LINE-1, HERVK-10 and the mouse VL30 retroelements, tagged with an enhanced green fluorescence (EGFP) gene-based retrotransposition cassette. Plasmid vectors were spontaneously taken up by mouse epididymal spermatozoa and were transferred in oocytes via in vitro fertilization. To explore the effect of reverse transcriptase inhibition on gametogenesis in male and female mice, were treated with the inhibitors Lamivudine and Nevirapine, for 10 weeks. After treatment, sperm parameters, testicular and ovarian morphology were examined.Our findings show that a) Sperm cell incorporates cloned retroelements and favors retrotransposition events, b) Spermatozoa can transfer cloned human or mouse retroelements to the oocyte during fertilization, c) Retroelement overexpression affects embryo morphology and impairs preimplantation, d) Reverse transcriptase inhibition by the use of antiretroviral drugs impairs the normal process of gametogenesis and the preimplantation development of mouse embryos. 160 σ. |
