| Popis: |
Οι βιοδείκτες είναι μόρια ο προσδιορισμός των οποίων στα κλινικά εργαστήρια έχει μεγάλη διαγνωστική και κλινική αξία. Ο προσδιορισμός βιοδεικτών μπορεί να γίνει σε διάφορα βιολογικά υγρά, με το αίμα και τα ούρα να είναι τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα. Η υγρή χρωματογραφία συζευγμένη με φασματομετρία μάζας (LC-MS/MS) αποτελεί μια από τις ευρύτερα εφαρμοζόμενες αναλυτικές τεχνικές στην ανάλυση βιοδεικτών, με πλεονεκτήματα όπως ανάλυση μικρού όγκου δειγμάτων, την ταχύτητα ανάλυσης, τον ταυτόχρονο προσδιορισμό πολλών αναλυτών, τη μεγάλη εξειδίκευση, τον προσδιορισμό θερμικά ασταθών και μη πτητικών ενώσεων, την αποφυγή παραγωγοποίησης των αναλυτών κλπ. Η προαναλυτική επεξεργασία βιολογικών δειγμάτων για προσδιορισμό διαφόρων βιοδεικτών σε ένα κλινικό εργαστήριο αποτελεί απαραίτητο στάδιο που προηγείται της ανάλυσης με υγρή χρωματογραφία – φασματομετρία μάζας. Η σημασία της είναι καθοριστική, και εξασφαλίζει αξιόπιστα αποτελέσματα για την σωστή διάγνωση, πρόβλεψη, παρακολούθηση ασθενειών και προσδιορισμό επιπέδων φαρμάκων. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η ανασκόπηση και παρουσίαση επιλεγμένων τεχνικών προκατεργασίας βιολογικών υγρών για την ανάλυση βιοδεικτών, με εφαρμογή της μεθοδολογίας LC-MS/MS. Η καταβύθιση πρωτεϊνών, η εκχύλιση στερεάς φάσης και η υγρή-υγρή εκχύλιση αποτελούν τις βασικές τεχνικές προκατεργασίας. Εκτός από αυτές, σήμερα χρησιμοποιούνται τεχνικές οι οποίες αποτελούν νέες τεχνικές ή εξέλιξη των κλασσικών τεχνικών ώστε να επιτρέπουν ανάλυση μικρότερων όγκων βιολογικών υγρών. Σε αυτές συμπεριλαμβάνονται η μικροεκχύλιση στερεάς φάσης, η εκχύλιση υγρού – υγρού με εξαλάτωση, η εκχύλιση σε αδρανές στερεό υπόστρωμα, η εκχύλιση προσρόφησης σε υφασμάτινο μέσο, η εκχύλιση με προσροφητική ράβδο ανάδευσης, η μικροεκχύλιση με πακτωμένο προσροφητικό υλικό και η εκχύλιση με περιστρεφόμενη στήλη μονολιθίου. Επιπλέον τεχνολογίες όπως οι πλάκες αφαίρεσης φωσφολιπιδίων, τα μαγνητικά σφαιρίδια, η εκχύλιση τυρβώδους ροής καθώς και η χρήση νεότερων υλικών όπως οι νανοσωλήνες άνθρακα, υλικά περιορισμένης πρόσβασης, ανοσοπροσροφητικά, μοριακά αποτυπωμένα πολυμερή και απταμερή επιτρέπουν μεγαλύτερη ανάκτηση των αναλυτών και απομάκρυνση των παρεμποδίζουσων ουσιών και συμβάλλουν στην επίτευξη αποτελεσμάτων με μεγαλύτερη ειδικότητα και ευαισθησία. Για την εκτέλεση αυτών των τεχνικών χρησιμοποιούνται διάφορα προσροφητικά υλικά και διαλυτές έκλουσης. Συμπέρασμα της εργασίας αυτής είναι ότι για την επιλογή μιας τεχνικής προκατεργασίας δείγματος για προσδιορισμό ενός βιοδείκτη, πρέπει να λαμβάνονται υπόψιν παράμετροι όπως οι χημικές ιδιότητες του βιοδείκτη, το κόστος και ο χρόνος που απαιτείται για την διενέργεια την συγκεκριμένης ανάλυσης καθώς και ο εργαστηριακός εξοπλισμός που διαθέτει κάθε εργαστήριο. Τέλος, η απόδοση που προσφέρει η εκάστοτε τεχνική σε επίπεδο ευαισθησίας και ειδικότητας είναι ίσως ο πιο σημαντικός παράγοντας που θα οδηγήσει στην επιλογή της τεχνικής που θα εφαρμοστεί για αναλύσεις ρουτίνας του εργαστηρίου. Biomarkers are molecules whose determination in clinical laboratories has great diagnostic and clinical value. The determination of biomarkers can be performed in various biological fluids, with blood and urine being the most widely used. Liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS) is one of the most widely applied analytical techniques in biomarker analysis, due to its advantages over others, such as high specificity and sensitivity, speed, small sample volume, simultaneous determination of multiple analytes, determination of thermally unstable and non-volatile compounds, the avoidance of derivatization of the analytes, etc. The pre-analytical processing of biological samples is a mandatory step for the determination of various biomarkers by liquid chromatography-mass spectrometry. Its importance is decisive, and ensures reliable results for the correct diagnosis, prediction, monitoring of diseases and determination of drug levels. The purpose of this work is to review and present selected sample preparation techniques of biological fluids suitable for the analysis of biomarkers, applying the LC-MS/MS methodology. Protein precipitation, solid phase extraction and liquid-liquid extraction are the mainly used pretreatment techniques. Moreover, new techniques or evolution of classic techniques are used today, allowing the analysis of smaller volumes of biological fluids by using smaller volumes of elution solvents. These include solid phase microextraction, salting-out assisted liquid–liquid extraction, supported liquid extraction, fabric phase sorptive extraction, stir bar sorptive extraction, microextraction by packed sorbent and monolithic spin column extraction. Additional technologies, such as phospholipid removal plates, magnetic beads, turbulent flow extraction, as well as, the use of newer materials, such as carbon nanotubes, restricted access materials, immunosorbents, molecularly imprinted polymers and aptamers, enable greater recovery of analytes and removal of interfering substances, and resulting to more specific and sensitive biomarkers identification and quantification. In conclusion, the selection of the most suitable sample preparation technique for the determination of specific biomarker, should be based on the evaluation of the following parameters: the chemical properties of the biomarker, the cost and the time required to perform the specific analysis as well as the available laboratory equipment. Furthermore, the performance offered by each technique in terms of sensitivity and specificity is probably the most important factor that will affect the choice of the applied technique for routine laboratory analyses. 114 σ. |
