| Přispěvatelé: |
Φριλίγγος, Ευστάθιος, Παπαμαρκάκη, Θωμαΐς, Χριστοφορίδης, Σάββας, Κωλέττας, Ευάγγελος, Πολίτου, Αναστασία |
| Popis: |
Η παρούσα εργασία αναφέρεται στην εξελικτική ανάλυση των διαφορών εξειδίκευσης σε μεταφορείς πoυρινών της οικογένειας NAT/NCS2, με τη μέθοδο Ανασύστασης Προγονικών Αλληλουχιών η οποία εφαρμόζεται για πρώτη φορά σε πρωτεϊνες διαμεμβρανικής μεταφοράς. Ειδικότερα, ασχοληθήκαμε με τον κλάδο των ορθολόγων του μεταφορέα ξανθίνης XanQ της E.coli, για τον οποίο έχει ήδη ανασυσταθεί στο εργαστήριό μας η προγονική αλληλουχία AncXanQ, και έχει χαρακτηριστεί ως μεταφορέας ξανθίνης-γουανίνης ευρείας εξειδίκευσης. Σε προηγούμενα πειράματα είχαν διερευνηθεί οι διαφορές αμινοξέων που σχετίζονται με τη μετάβαση από τον ευρείας εξειδίκευσης, AncXanQ, στο σημερινό, αυστηρής εξειδίκευσης, μεταφορέα ξανθίνης XanQ και είχαν εντοπιστεί πέντε σημαντικά αμινοξέα (Τατσάκη Α., αδημοσίευτα αποτελέσματα). Στη δική μας εργασία (μεταπτυχιακή διατριβή), χαρακτηρίσαμε τον σύγχρονο μεταφορέα διπλής εξειδίκευσης, για ξανθίνη και γουανίνη, NmXanQ, του παθογόνου Neisseria meningitidis, ως αντιπροσωπευτικό ενός υποκλάδου μεταφορέων ξανθίνης, που διατηρεί τα πέντε αμινοξέα που είναι σημαντικά για την ευρεία εξειδίκευση του AncXanQ. Βασιζόμενοι, λοιπόν, στη μέθοδο Ανασύστασης Προγονικών Αλληλουχιών, μπορέσαμε να προβλέψουμε επιτυχώς το λειτουργικό προφίλ εξειδίκευσης ενός σύγχρονου μεταφορέα, εντοπίζοντας μάλιστα πρώτη φορά ενεργότητα μεταφοράς γουανίνης στο συγκεκριμένο κλάδο. Επίσης, μελετήθηκε η συνεισφορά μίας εκ των πέντε διαφορετικών θέσεων, της Ser/Gly-377 στην εξειδίκευση. Κατασκευάστηκαν και χαρακτηρίστηκαν τα αντίστοιχα μεταλλάγματα στη θέση αυτή, σε διαφορετικά μοριακά περιβάλλοντα μεταφορέων ευρείας (NmXanQ/G377S, AncXanQ/G377S) και περιορισμένης εξειδίκευσης (XanQ/S377G). Η παρουσία Gly-377 συνδέεται με την ευρύτερη εξειδίκευση. Η αντικατάστασή της με Ser-377 δεν οδηγεί από μόνη της σε περιορισμό της εξειδίκευσης. Αντίθετα, η αντικατάσταση της Ser-377 με Gly-377 αρκεί για να μετατρέψει τον XanQ σε μεταφορέα ευρύτερης εξειδίκευσης, για ξανθίνη και γουανίνη. Έτσι φαίνεται η συμβολή της Ανασύστασης Προγονικών Αλληλουχιών στον εντοπισμό ενός σημαντικού αμινοξέος για την εξειδίκευση, στη θέση 377, που δεν είχε εντοπιστεί σε προηγούμενες μελέτες. The subject of this study is the evolutionary analysis of specificity differences among members of the NAT/NCS2 family of purine transporters, using the strategy of Ancestral Protein Reconstruction, which is applied for the first time to transmembrane transporters. Specifically, we study the xanthine permease cluster, represented by the xanthine-specific permease XanQ of Ε. coli. In previous experiments in the lab, the common ancestor of xanthine-specific homologs, AncXanQ, has been reconstructed, expressed and analyzed in E. coli K-12 and found to be a transporter for both xanthine and guanine, with broad specificity for purines. Its broader specificity relative to XanQ has been attributed to five differences in amino acids, peripheral to the substrate biding site (Tatsaki E., unpublished results). In the current thesis we characterized the Neisseria meningitidis ortholog (NmXanQ), which retains the five residues considered to be important for the broad profile of AncXanQ, and proved that it is a xanthine/guanine permease, consistent with the predictions of the Ancestral Reconstruction approach. In addition, this is the first member of this cluster to exhibit broader specificity. We also studied the specificity role of Ser/Gly-377, one of the five putatively important differences between AncXanQ and XanQ. We constructed and characterized mutants in broad-specificity backgrounds (NmXanQ/G377S, AncXanQ/G377S) and in the xanthine-specific XanQ (XanQ/S377G). Gly-377 is linked with the broader specificity. Replacement of Gly-377 with Ser-377 maintained the ability of AncXanQ and NmXanQ to transport both substrates, but replacement of Ser-377 with Gly-377 was sufficient to change XanQ to a broader purine permease recognizing both xanthine and guanine. Thus, the Ancestral Reconstruction approach allowed us to uncover a specificity role of Ser/Gly-377, which had not been revealed by any of the previous studies. 123 σ. |
