| Popis: |
Mikrotübüller, alfa ve beta tubulin heterodimerlerinden olusan hücre iskeletipolimerleridirler. Hücre içi tasıma, hücre hareketi, hücre bölünmesi gibi olaylardagörevlidirler. Sinir hücrelerinde, MTler hücrenin büyümesine destek saglamaklaberaber hücresel yapının sekillenmesinde, akson ve dendritlerin olusumunda daetkilidirler.Katanin ve spastin MT kesici enzimlerdir. Katanin iki alt üniteden olusur, p60 ve p80.Spastin, p60?katanin alt ünitesi ile büyük benzerlik göstermektedir. Spastinin en fazlailgi çeken proteinlerden biri haline gelmesinin nedeni de bu proteinin MT temel hücrebiyolojisini nörolojik hastalıklarla birlestirmesidir. Spastinin mutasyonunda kalıtsalspastik parapleji rahatsızlıgına neden oldugu bilinmektedir.Çalısmadaki hedefimiz spastinin karakterizasyonunda yeni adımlar atabilmek, MTlerinspastin, katanin tarafından kesilmesinin mikrotübül iliskili proteinler tarafındandüzenlenmesini aydınlatmaya çalısmaktır. Çalısmanın bu kısmında MTler üzerindekoruyucu görevleri olan mikrotübül?iliskili proteinler, özellikle de MAP1b ve MAP2cüzerinde durulmustur.Spastinin görevini aydınlatabilmek için hipokampüs hücrelerinde GFP, spastin, p60?katanin proteinlerinin ekspresyonu gerçeklestirildi. Hücreler transfeksiyonu takip eden2. ve 4. günlerde sabitlendi. Birincil ve ikincil antikorlar ile boyandıktan sonra hücrelerflüoresan mikroskobu ile incelendi. Kontrol hücreleri, katanin ve spastin proteinleriniasırı eksprese eden hücreler aralarında karsılastırıldı.Çalısmanın ikinci kısmında ise mikrotübül iliskili proteinlerin, p60?katanin ve spastineksprese eden hücreler üzerinde herhangi bir düzenleyici rolünün olup olmadıgıaydınlatılmaya çalısıldı. P60?katanin ve spastin proteinleri mikrotübül iliskiliproteinlerin varlıgında ya da bu proteinler olmadan fibroblast hücrelerinde ekspreseedildiler. Transfeksiyonu takip eden günde hücreler sabitlendi. Birincil ve ikincilantikorlarla isaretlendikten sonra hücreler flüoresan mikroskobunda incelendiler.Anahtar sözcükler: Spastin, Katanin, Mikrotübüle-iliskili Proteinler Microtubules are cytoskeletal polymers made of alpha and beta tubulin heterodimers.They have role in cell transport, cell motility and cell division. In neurons, MTs providesupport for the growth and maintenance of the axonal and dendritic processes.Katanin and spastin are MT severing enzymes. Katanin has two subunits, p60 and p80.P60 subunit has high homology with spastin. Spastin became popular because it hasbrought basic MT cell biology into the neurological disorders. It is known that spastinmutation leads to neurological disorder, hereditary spastic paraplegia.Our aim was to characterize spastin and also to identify the regulation mechanisms ofMT severing by spastin and katanin. We concentrated on MAP1b and MAP2c proteinsthat have protective role over MTs.In the first part of the study, we have worked with hippocampus cells. We overexpressedGFP, p60 ?katanin and spastin constructs in hippocampal cells. Cells were fixed at theparticular time points following transfection. After fixation, immunostaining was doneand then by using primary and secondary antibodies cells were analyzed with fluorescentmicroscopy. Control cells, p60 ?katanin overexpressing and spastin overexpressing cellswere compared with each others.In the second part of the work, MAP?s protective functions were analyzed in spastin andp60?katanin over expressing cells. P60 ?katanin and spastin constructs wereoverexpressed with and without MAP1b and MAP2c in living fibroblast cells, RFL-6.Cells were fixed on the following day of transfection and stained with primary andsecondary antibodies. After immunostaining, cells were analyzed with fluorescentmicroscopy.Keywords: Spastin, Katanin, Microtubule-associated Proteins 88 |
