| Popis: |
ÖZSTREPTOMYCES CLAVULIGERUS'DA HOMOSERİN DEHİDROGENAZGENİNİN HEDEFLENMİŞ BLOKASYONU VE BUNUN SEFAMİSİN CÜRETİMİ ÜZERİNE ETKİLERİKoca Çaydaşı, AyşeYüksek Lisans, Biyoloji BölümüTez Yöneticisi: Prof. Dr. Gülay ÖzcengizYardımcı Tez Yöneticisi: Yrd. Doç. Dr. Ebru İnce YılmazTemmuz 2006, 94 sayfatürleri, yüksek kapasitede protein ve sekonder metabolitStreptomycesüreticisidirler. Bu grubun önemli türlerinden biri olan Streptomyces clavuligerussekonder metabolit olarak tıbbi açıdan oldukça değerli bir β-laktam antibiyotiği olansefamisin C ve güçlü bir β-laktamaz inhibitörü olan klavulanik asit üretmektedir. S.aspartik asit metabolik yolu β-laktam sentezi için öncülclavuligerus'unmetabolitler sağladığı için çok önemlidir. Bu metabolik yoldan L-lizin, L-metiyonin, L-izolösin ve L-treonin gibi 4 temel amino asit sentezlendiği gibi bir çokönemli öncül metabolit de oluşmaktadır. β-laktam sentezi için gerekli bir öncül olanL-α-aminoadipik-asit (α-AAA), aspartat metabolit yolundan sentezlenen L-lizininkatabolik bir ürünüdür. Aspartik asit yolunun L-lizin dalındaki karbon akışının,sefamisin C biyosentezi için hız sınırlayıcı olduğu bilinmektedir. Aspartatsemialdehid (ASA)'den L-homoserin sentezlenmesi, aspartat metabolik yolunun L-treonin, L- metiyonin ve L-izolösin sentezinine giden çatalının ilk enzimatikreaksiyonudur ve homoserin dehidrogenaz (HSD, EC 1.1.1.3) enzimi tarafındankatalizlenmektedir. S. clavuligerus'ta L-lizin ve α-AAA sentezi için gerekli ASAmiktarı, HSD'ın hücredeki biyosentez seviyesi veya aktivitesinin regulasyonu ilekontrol edilir.NRRL 3585'in homoserin dehidrogenaz geni (hom)S. clavuligeruslaboratuvarımızda daha önce klonlanıp karakterize edilmişti. Şimdiki çalışmada, S.clavuligerus'un hom geni, içine kanamisin dirençlilik kaseti sokulmak suretiyletahrip edilmiş ve inaktive edilen gen bir Streptomyces plazmid vektörü olan pIJ486içerisinde S. clavuligerus'a aktarılmıştır. Kromozomal hom geni ve plazmidüzerindeki bloke edilmiş hom geni arasındaki homolog rekombinasyon sonucuoluşan hom okzotrof bir suş (AK39) seçilmiş ve hom geni blokasyonun sefamisin Cüretimine etkisi incelenmiştir. hom geninin blokasyonu sonucunda, kimyasal olaraktanımlanmış (CDM) besiyerinde sefamisin C spesifik üretiminde 1.7 ile 2.0 misliartış gözlenmiştir.Anahtar kelimeler: Streptomyces clavuligerus; homoserin dehidrogenaz, sefamisinC, aspartat metabolik yolu, gen blokasyonu ABSTRACTTARGETED DISRUPTION OF HOMOSERINE DEHYDROGENASE GENEIN STREPTOMYCES CLAVULIGERUS AND ITS EFFECTS ONCEPHAMYCIN C PRODUCTIONKoca Çaydaşı, AyşeM. Sc., Department of BiologySupervisor: Prof. Dr. Gülay ÖzcengizCo-Supervisor: Assist. Prof. Dr. Ebru İnce YılmazJuly 2006, 94 pagesThe members of the genus Streptomyces are well-known for their capacity tosynthesize a vast repertoire of secondary metabolites, including many usefulantibiotics and proteins. Streptomyces clavuligerus is the producer of the medicallyimportant β-lactam antibiotics such as cephamycin C and the potent β-lactamaseinhibitor clavulanic acid. The aspartate pathway of S. clavuligerus is an importantprimary metabolic pathway providing substrates for β-lactam synthesis. Thispathway uses L-aspartic acid as the precursor for the biosynthesis of the aminoacids L-lysine, L-methionine, L-isoleucine, L-threonine and several importantmetabolic intermediates. L-α-aminoadipic acid (α-AAA) required for β-lactamsynthesis is a catabolic product of L-lysine produced from the lysine branch of theaspartate pathway. The carbon flow through the L-lysine-specific branch ofaspartate pathway is limiting for the formation of cephamycin C. Formation of L-homoserine from aspartate semialdehyde (ASA) is the first step of the other branchof the aspartate pathway leading to L-threonine, L-isoleucine and L-methioninesynthesis and is catalyzed by homoserine dehydrogenase (HSD, EC 1.1.1.3).Regulation of the activity or biosynthesis of the HSD of S. clavuligerus determinesthe availability of ASA for the biosynthesis of L-lysine and α-AAA.The gene encoding for homoserine dehydrogenase (hom) was previously clonedfrom S. clavuligerus NRRL 3585 and characterized in our laboratory. In this study,the hom gene was disrupted via insertion of a kanamycin resistance cassette intothis gene which was subsequently transferred to S. clavuligerus cells using theStreptomyces plasmid vector pIJ486. A hom mutant of S. clavuligerus (AK39) wasformed through integration into the chromosome by double crossing over and theeffects of hom disruption on cephamycin C yields were investigated. Disruption ofhom gene resulted in a 1.7 to 2.0 fold increase in specific cephamycin C productionin chemically defined medium (CDM).Keywords: Streptomyces clavuligerus; homoserine dehydrogenase, cephamycin C,aspartate pathway, gene disruption. 111 |
