| Popis: |
Bu çalışmada yeni antiviral moleküllerin taranması için Hepatit delta virüsünün replike olabildiği hücre kültür sisteminin oluşturulması amaçlanmaktadır. Bunun için öncelikle hücre kültür sistemi için yaygın olarak kullanılan Huh-7 hücre hattı seçilmiş ve bu hücreler kültürde büyütülmüştür. Daha sonra transfeksiyona hazır hale gelen Huh-7 hücrelerine, HDV cDNA'sını içeren plazmit kimyasal yöntem kullanılarak transfekte edilmiştir. Transfeksiyonda pozitif kontrol olarak GFP kullanılmıştır ve HDV plazmiti ile GFP transfeksiyonu birlikte yapılmaktadır. GFP ışımaları transfeksiyonun başarılı olduğu anlamına gelmektedir. Daha sonra hücre kültür siteminden örnekler toplanıp, trizol kimyasalı yöntemi ile total RNA izolasyonu yapılmıştır. Bu örneklerden HDV Real-Time RT PCR yöntemi ile virüs kopya sayısı belirlenmiş ve HDV genomunun replikasyon oranına bakılmıştır. Real-Time RT PCR ve konvansiyonel PCR sonuçları incelendiğinde sistemde virüs replikasyonu gözlemlenmiştir, ancak istenilen yükseklikte kopya sayısı elde edilememiştir. Replikasyonun en çok olduğu günler ise 5. ve 6. günler olarak görülmüştür. Bu sistem ileri aşamalarda virüs üzerinde ilaç etkileşimlerinin gözlemlenmesi amacıyla kullanılabilir, ancak ilaç etkileşimlerini incelemek için virüs kopya sayısı yükseltilmelidir. The aim of this study is development of a novel cell culture system for hepatitis delta virus genome replication to study new antiviral agents. Firstly, common Huh-7 cell line was selected and they were cultured. After cultivation, plasmid wich contains HDV cDNA sequnce and GFP were cotransfected into the cell line chemically. Transfection was accepted succesful by controling GFP under fluorescence microscopy. After controling, samples were collected from cell culture and total RNA was extracted with Tri Reagent method. Total RNAs were amplified by Real-Time RT PCR and conventional PCR methods. According to Real-Time RT PCR results, HDV could replicate in system, but the viral load copy was not enuogh for studying antiviral agents. The highest viral load was seen in 5. and 6. days. This system is using for studying antiviral agents-virus interaction, but viral load must be increased. 68 |
