Untersuchung Endo H- und PNGase F-abgespaltener N-Glykane in humanem Blutserum

Autor: Frisch, Elena
Jazyk: němčina
Rok vydání: 2013
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Popis: Glykane bilden zelltypische Muster auf Zelloberflächen aus, die sich während der Entwicklung, Differenzierung oder Erkrankung einer Zelle in charakteristischer Weise ändern. Zurzeit wird die veränderte Glykosylierung der humanen Glykoproteine als spezifischer Biomarkerkandidat in der Diagnose diverser Erkrankungen wie Krebs oder Entzündungserkrankungen diskutiert (Dennis et al. 1999; Reis et al. 2010). Im Rahmen dieser Arbeit wurde die N-Glykosylierung des humanen Blutserums und die N- und O-Glykosylierung des humanen Speichels analysiert. Blutserum N-Glykosylierung Die N-Glykane des High-Mannose und Hybrid-Typs spielen eine wichtige Rolle in der Immunantwort. Mit Hilfe des Enzyms Endo H wurden selektiv die N-Glykane des High-Mannose und die Hybrid-Typs aus humanem Blutserum isoliert und mit MALDI-TOF-MS, MALDI-TOF /TOF-MS, HPAEC-PAD und CE-LIF charakterisiert. Die Messmethode der CE-LIF ermöglichte nicht nur eine schnellere Detektion von Glykanen, sondern auch die Analyse ihrer Isomerstrukturen. Die Migrationszeiten der High-Mannosen (Man5-9) wurden im Elektropherogramm über das Kontrollprotein RNase B zugeordnet. Die Endo H-freigesetzten N-Glykane wurden an der HPAEC-PAD getrennt und die erhaltenen Fraktionen an der CE-LIF analysiert, was eine endgültige Zuordnung der neutralen und der negativ geladenen sialylierten N-Glykane des Hybrid-Typs in den Elekropherogrammen der CE-LIF ermöglichte. Für eine diagnostische Anwendung der Analyse des Blutserumglykoms sollte der Schritt der Abspaltung und der Aufreinigung der Glykane kosten- und zeiteffizient sein. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die MAED-Methode (Microwave- Assisted Enzymatic Digestion) zur Denaturierung der Serumproteine und zur enzymatischen N-Glykanfreisetzung mit anschließender Aufreinigng über selbstbefüllte SP20SS- und Graphit-Spitzen entwickelt. Die Denaturierung mit Pronase und die Endo H-Freisetzung der N-Glykane in der Mikrowelle erfolgte nacheinander innerhalb von 10 min (2 x 5 min; 700 Watt). Der Aufreinigungsschritt erfolgte über selbstbefüllte SP20SS- und Graphit-Spitzen. Außerdem sank das Elutionsvolumen von 1,2 mL bei C18/Carbograph auf 90 µL bei SP20SS/Graphit und minimierte damit die Trocknungszeit der Lösungsmittel von 3 h auf 30 min. Insgesamt konnte die Aufbereitungszeit der Blutserum N-Glykane von 21 Stunden auf eine Stunde reduziert werden. Aufbauend auf den Resultaten der MAED-Methode, SP20SS/Graphit-Aufreinigung und der Messung an der CE-LIF wurden diagnostische Untersuchungen Endo H-freigesetzter N-Glykane durchgeführt. Ein Vergleich des Glykom von gesunden Probanden und dem von Patienten mit diagnostiziertem Ovarial- und Colonkarzinom zeigte deutlich, dass die beiden sialylierten Hybrid-Strukturen Neu5AcGalMan4GlcNAc2 und Neu5AcGalMan5GlcNAc2, ausschließlich in der Patientengruppe mit Ovarialkarzinom, unterexprimiert werden. Außerdem wurde eine Unterexpression im zweiten und dritten Isomer der High-Mannose Man7GlcNAc bei Ovarial- und Colonkarzinom beobachtet. Die während der PNGase F-MAED erzeugten Oxazolinderivate wurden in Transglykosylierungsreaktionen eingesetzt. Die in vitro Expression von Glykoproteinen könnte eine Möglichkeit für effektive und spezifische Therapheutika gegen gezielte Erkrankungen liefern. Die Transglykosylierungsreaktionen wurden mit Endo M durchgeführt. Das diantennäre N-Glykan des Transferrins wurde auf die Endo H-behandelte RNase B mit Hilfe von Endo M katalysiert. Speichel Glykosylierung Mit der MAED-Methode für die Denaturierung der Speichelglykoproteine und der Aufkonzentrierung der Glykopeptide über die ZIC®-HILIC Säule wurde eine schnelle Methode entwickelt, die eine hohe Ausbeute an N- und O-Glykanen liefert. Die stufenweise Freisetzung der N- und O-Glykane lieferte eine Fülle an strukturellen Informationen. Die N-Glykane wurden hierzu enzymatisch (PNGase F) und die O-Glykane chemisch (β-Eliminierung) freigesetzt und aufgereinigt. Die N- und O-Glykosylierungen des humanen Speichels wurden massenspektrometrisch an MALDI-TOF-MS und MALDI-TOF/TOF-MS untersucht. Dabei wurde unter anderem der Sekretor-Status, Sialylierungs-, Sulfatierungs- und Fucosylierungsgrad charakterisiert. Zusätzlich wurden Strukturisomere der N- und O-Glykane untersucht. Die MALDI-TOF-MS Analyse der N-Glykane lieferte eine hohe Strukturvielfalt an mehrfach fucosylierten und/oder sialylierten di-, tri- und tetraantennären N-Glykanen des Komplex-, High-Mannose- und Hybrid-Typs. Die O-Glykanstrukturen konnten von 500 bis 4000 m/z detektiert werden. In Speichelproben mit Sekretor-Status dominierten fucosylierte O-Glykane und in Proben mit Nicht-Sekretor-Status dominierten sialylierte O-Glykane. Außerdem konnten core-1, core-2, core-3 und core-4, Lewis-Epitope: Lea/x-, Leb/y und sLea/x-Epitope sowie ABH-Epitope in Abhängigkeit von der Blutgruppe nachgewiesen werden.
Glycans form cell-specific patterns on cell surfaces, which alter in a typical manner during development, differentiation or infection of a cell. Nowadays, changes in the glycosylation are discussed as biomarkers in the diagnosis of multiple diseases such as cancer or inflammation (Dennis et al. 1999; Reis et al. 2010). In the present work the N-glycosylation of human blood serum and the N- and O-glycosylation of human saliva was analysed. Blood serum N-glycosylation High-mannose and hybrid-type N-glycans play an important role in the immune response. Using the enzyme Endo H, high-mannose and hybrid type N-glycans in human blood serum could selectively be released and characterised by MALDI-TOF-MS, MALDI-TOF/TOF-MS, HPAEC-PAD and CE-LIF. Analysis of oligosaccharide structures using CE-LIF not only led to a faster detection of glycans, but also made an analysis of structural isomers possible. Electropherogram migration times of high-mannose oligosaccharides were assigned by comparison with known structures generated from control protein RNase B. The Endo H-released N-glycan pool was seperated by HPEAC-PAD and the obtained fractions were analysed by CE-LIF allowing for an unambiguous identification of the N-glycan hybride-types. In order to develop diagnostic applications based on the analysis of the human blood serum glycom, glycan release and purification must be time- and cost-efficient. In the present work a MAED-method (Microwave-Assisted Enzymatic Digestion) for the denaturation of serum proteins and the enzymatical release of N-glycans with subsequent purification over self-made SP20SS/graphite tips was developed. The denaturation with Pronase and the Endo H release of N-glycans was performed in a microwave during 10 min (2 x 5 min; 700 Watt). The purification step was performed on self-made SP20SS/graphite tips. Furthermore, the elution volumes were reduced from 1,2 mL by C18/Carbograph to 90 µL by SP20SS/graphite tips which minimised the evaporation time of solvent from 3 h to 30 min. In summary the time necessary for the preparation of blood serum N-glycans was reduced from 21 hours to one hour. Based on the results obtained from the MAED-method, SP20SS/graphite purification and CE-LIF analysis, diagnostic studies Endo H released N-glycans could be realised. Comparison between the glycom of healthy control and patients with ovarian and colon cancer showed that the sialylated hybrid structures Neu5AcGalMan4GlcNAc2 and Neu5AcGalMan5GlcNAc2 were significantly under-expressed in samples with ovarian cancer. Furthermore, in samples with ovarian and colon cancer an under expression in the second and third isomer of high-mannose Man7GlcNAc was observed. The oxazoline derivatives generated in the PNGase F-MAED were used in transglycosylation reactions. The in vitro expression of glycoproteins could provide a new route for efficient and specific therapeutic agents against certain diseases. Endo M catalysed the transglycoslation reaction between oxazoline derivatives and modified RNase B protein. During the transglycosylation reaction diantennary N-glycan of transferrin was transferred by Endo M of the Endo H treated RNase B. Human saliva glycosylation With the MAED-method for the denaturation of saliva glycoproteins and the concentration of the glycopeptides on a ZIC®-HILIC column, a rapid method could be developed which provides high yields on N- and O-glycans. The consecutive release of N- and O-glycans afforded multiple structural informations. N-glycans were enzymatically released (PNGase F) and O-glycans chemically (β-elimination). The N- and O-glycosylation of human saliva was analysed by MALDI-TOF-MS und MALDI-TOF /TOF-MS. Thereby, the secretor-status, sialylation, sulfatation and fucosylaltion was identified and characterised. In addition, isomeric structures of N- and O-glycans were analysed. The MALDI-TOF-MS analysis of N-glycans provided a high structural diversity in high fucosylated and/or sialylated di-, tri- and tetra-antennary complex-typ N-glycans, high-mannose and hybrid-typ N-glycans. O-glycans could be detected from m/z 500 to m/z 4000. Saliva samples with secretor-status were found to be dominated by fucosylated O-glycans whereas in samples with non-secretor-status, sialylated O-glycans were found to be most abundant. Furthermore, depending on the blood group it was possible to identify core-1, core-2, core-3 and core-4 structures, lewis-epitopes: Lea/x-, Leb/y- and sLea/x-epitope and ABH- epitopes.
Databáze: OpenAIRE
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