Proteinske promjene u leđnoj moždini neonatalnih oposuma tijekom razdoblja kada regeneracija prestaje biti moguća
| Autor: | Tomljanović, Ivana |
|---|---|
| Přispěvatelé: | Mladinić Pejatović, Miranda, Ratkaj, Ivana, Bradshaw, Nicholas James, Švob Štrac, Dubravka |
| Jazyk: | angličtina |
| Rok vydání: | 2023 |
| Předmět: | |
| Popis: | One of the major challenges of modern neurobiology concerns the inability of the adult mammalian central nervous system (CNS) to regenerate and repair itself after injury. It is poorly understood why regenerative potential is lost with evolution and development and why it becomes very limited in adult mammals. Even though our understanding of molecular and cellular mechanisms that promote or inhibit neuronal regeneration is expanding, it is still unclear what are the key differences between the neuronal systems that can and cannot regenerate, and how they can be manipulated to change the outcome of the injury. Our incomplete understanding of molecular events underlying neuronal development and regeneration is the main reason why neurodegenerative diseases and brain and spinal cord injuries are still mostly incurable today. A preferred model to study and reveal the cellular and molecular basis of regeneration is the neonatal opossum (Monodelphis domestica). Opossums are marsupials that are born very immature with the unique possibility to successfully regenerate spinal cord after injury in the first two weeks of their life. After that, the regenerative capacity is abruptly lost: at 14 days in cervical spinal segments and at 17 days in less mature lumbar spinal segments. In this thesis, we used neonatal opossums to study molecular and cellular properties of spinal tissue that has and does not have the capacity to regenerate after injury, to pinpoint the key differences. Using a comparative proteomic approach, for the first time, we identified the proteins unique and differentially distributed in the intact opossum spinal tissue with different regenerative capacities. We have identified a total number of 4735 proteins involved in various cellular processes such as cell growth, proliferation, differentiation, transcription, cell signaling, cytoskeleton and extracellular matrix organization, axon guidance molecules, neurotrophic factors and entire intracellular molecular pathways like mTOR and MAPK signaling pathway. We have also identified many myelin associated proteins, known to act as inhibitors of CNS axon regeneration, which was the positive control for our overall experimental procedure. Most interestingly, we have identified a number of proteins related to different neurodegenerative diseases that change in the opossum spinal cord during the period critical for neuroregeneration. The different distribution of the selected proteins detected by comparative proteomics was further confirmed by Western blot, and the changes in the expression of related genes were analyzed by quantitative reverse transcription PCR. Furthermore, we explored the cellular localization of the selected proteins using immunofluorescent microscopy. We showed that during the period of development when viii regeneration stops being possible, the substantial number of proteins known to be involved in regeneration and development change their level in the opossum spinal cord. These results upgraded the previous transcriptomic data about the genes differentially expressed in regenerating and non-regenerating opossum spinal cord tissue. Comparison of the data obtained by genomic and proteomic approaches allowed the identification of molecules of interest and narrowed the number of candidates for functional assays. For the first time, we successfully established primary neuronal spinal cell cultures from neonatal opossums of different ages and different regenerative capacities, which represent a novel mammalian in vitro platform, particularly useful to study CNS development and regeneration, and to test the functional role of the candidate molecules, together with the intact neonatal opossum spinal cord preparation. We have also developed the neuroregeneration scratch test to be performed on primary neuronal spinal cell cultures deriving from P5 opossums. Taken together, the results of this thesis contribute to a better understanding of neuronal regeneration in mammals and identify candidate molecules as future targets to promote neuroregeneration in mammalian CNS. Jedan od glavnih izazova suvremene neurobiologije je nemogućnost regeneracije središnjeg živčanog sustava (SŽS) odraslih sisavaca nakon ozljede. Još uvijek nije jasno kako se i zašto sposobnost regeneracije gubi tijekom evolucije i razvoja, te zašto regeneracija kod odraslih sisavaca postaje iznimno ograničena. Iako se naše razumijevanje staničnih i molekularnih mehanizama koji potiču ili inhibiraju regeneraciju zadnjih godina sve više produbljuje, još uvijek je nejasno koje su to ključne razlike između živčanih sustava koji imaju i onih koji nemaju sposobnost regeneracije te kako ih manipulirati sa ciljem da se promjeni ishod ozljede. Naše nepotpuno razumijevanje molekularnih događaja koji su temelj razvoja i regeneracije živčanog tkiva je glavni razlog zašto su neurodegenerativne bolesti, kao i ozljede mozga i leđne moždine danas još uvijek neizlječive. Prikladan model za proučavanje i otkrivanje stanične i molekularne osnove regeneracije su mladi oposumi (Monodelphis domestica). Oposumi su tobolčari koji se rađaju nerazvijeni pa tijekom prva dva tjedna svog života posjeduju jedinstvenu sposobnost potpune regeneracije leđne moždine nakon ozljede. Nakon toga sposobnost regeneracije se naglo gubi: oko 14. dana u vratnom dijelu leđne moždine, te 17. dana u njenom manje razvijenom lumbalnom dijelu. Mlade oposume koristili smo za istraživanje molekularnih i staničnih svojstava tkiva leđne moždine koje ima sposobnost regeneracije nakon ozljede, te onog koje nema, kako bi se odredile ključne razlike. Uporabom komparativne proteomike, po prvi puta, identificirali smo proteine koji su jedinstveni i različito izraženi u tkivu leđnih moždina oposuma koji mogu i onih koji ne mogu regenerirati. Identificirali smo ukupno 4735 proteina koji sudjeluju u staničnom rastu, proliferaciji, diferencijaciji, transkripciji, staničnoj signalizaciji, organizaciji citoskeleta i izvanstaničnog matriksa, molekule koje usmjeravaju aksone, neurotrofne čimbenike i cijele unutarstanične molekularne puteve kao što su mTOR i MAPK signalni put. Također, identificirali smo niz proteina povezanih s mijelinom za koje se zna da djeluju kao inhibitori regeneracije aksona, što je bila pozitivna kontrola za naš cjelokupni eksperimentalni postupak. Kao najvažniji rezultat, otkrili smo da se mnoštvo proteina povezanih s neurodegenerativnim bolestima mijenja u leđnoj moždini oposuma u vremenu kada regeneracija prestaje biti moguća. Različita distribucija odabranih proteina dodatno je potvrđena Western blotom, a promjene u ekspresiji gena analizirane su metodom kvantitativne reverzne transkripcije lančane reakcije polimeraze. Nadalje, imunofluorescentnom mikroskopijom istražili smo staničnu lokalizaciju odabranih proteina. x Pokazali smo da se tijekom razvoja, u trenutku kada regeneracija prestane biti moguća, znatno mijenja razina proteina za koje se zna da kontroliraju regeneraciju i razvoj leđne moždine oposuma. Dobiveni rezultati su nadogradili prethodna istraživanja vezana za gene različito izražene u tkivu leđne moždine oposuma koje ima i onoga koje nema sposobnost regeneracije. Također, usporedbom rezultata komparativne transkriptomike i proteomike moguće je bilo identificirati molekule od interesa i suziti broj kandidata za funkcionalna istraživanja. Po prvi puta, uspješno smo uspostavili primarne stanične kulture leđne moždine oposuma različite dobi i različite regenerativne sposobnosti, koje predstavljaju novu in vitro platformu, posebno korisnu za proučavanje razvoja i regeneracije SŽS-a, kao i za funkcionalna istraživanja molekula kandidata u neuroregeneraciji, zajedno sa preparatom cjelovite leđne moždine oposuma održavanog u kulturi. Također, uspostavili smo test neuroregeneracije koji uključuje mehaničku ozljedu primarnih staničnih kultura dobivenih iz pet dana starih oposuma. Zaključno, rezultati ovog istraživanja doprinose boljem razumijevanju regeneracije živčanog tkiva sisavaca, te otkrivaju potencijalne terapijske molekularne mete koje bi mogle biti interesantne za neuroregeneraciju SŽS-a sisavaca. |
| Databáze: | OpenAIRE |
| Externí odkaz: |
|