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Fasciola hepatica produce, durante la infección, una serie de cisteínas tipo catepsina L la cual permiten al parásito la invasión, alimentación y evasión del sistema inmune. El tremátodo expresa 7 isoformas de Catepsina tipo L, siendo catepsina L5 (CatL5Fh) secretada en mayor proporción en el estadio adulto; por lo que se considera que esta proteinasa está involucrada en la supervivencia y alimentación ya que puede degradar componentes proteicos del hospedero definitivo. En la Unidad de Biotecnología Molecular (UBM) se ha determinado que CatL5Fh puede degradar ST3 (codificado en UBM) por lo cual resulta de interés evaluar esta cisteina proteinasa como un potencial agente de aplicación biomédico. Debido a que la purificación de CatL5Fh nativa a partir de parásitos adultos requiere de inversión de costo y tiempo resultando en bajos rendimientos de la proteinasa pura; el objetivo del presente estudio es expresar rCatL5Fh en el sistema de expresión del vector pET-26b(+) en las cepas BL21 y Rosetta de Escherichia coli, purificar y caracterizar su actividad con el sustrato ST3. rCatL5Fh fue clonada y expresada por fermentación con diferentes concentraciones de IPTG y en distintos tiempos para controlar la formación de cuerpos de inclusión. El más alto rendimiento de producción de rCatL5Fh purificada que se obtuvo con BL21 fue de 4.5 mg por 100 ml de cultivo con 1 mM de IPTG, 37 °C por 16 horas y con Rosetta fue de 6 mg por 100 ml con 0.25 mM de IPTG, 37 °C por 8 horas. Sin embargo, rCatL5Fh purificada por distintos procedimientos no tuvo actividad proteolítica por lo que se sugiere que esta proteinasa requiere transitar por el sistema de secreción para lograr las modificaciones post-traduccionales y el plegamiento adecuado de su forma activa, procesos que no ocurren en los sistemas de expresión procariotas. Fasciola hepatica produces, during infection, a series of cathepsin L-type cysteines which allow the parasite to invade, feed, and escape the immune system. The trematode expresses 7 isoforms of Cathepsin type L, being cathepsin L5 (CatL5Fh) secreted in a higher proportion in the adult stage; therefore, it is considered that this proteinase is involved in survival and feeding since it can degrade protein components of the definitive host. At the Molecular Biotechnology Unit (UBM) it has been determined that CatL5Fh can degrade ST3 (encoded in UBM), therefore it is of interest to evaluate this cysteine proteinase as a potential agent for biomedical application. Because the purification of native CatL5Fh from adult parasites requires investment of cost and time resulting in low yields of pure proteinase; The objective of the present study is to express rCatL5Fh in the expression system of the vector pET-26b (+) in the BL21 and Rosetta strains of Escherichia coli, to purify and characterize its activity with the ST3 substrate. rCatL5Fh was cloned and expressed by fermentation with different concentrations of IPTG and at different times to control the formation of inclusion bodies. The highest production yield of purified rCatL5Fh that was obtained with BL21 was 4.5 mg per 100 ml of culture with 1 mM IPTG, 37 ° C for 16 hours and with Rosetta it was 6 mg per 100 ml with 0.25 mM IPTG, 37 ° C for 8 hours. However, rCatL5Fh purified by different procedures did not have proteolytic activity, which is why it is suggested that this proteinase requires transit through the secretion system to achieve post-translational modifications and proper folding of its active form, processes that do not occur in systems of prokaryotic expression. |
