| Popis: |
Izoleucil-tRNA-sintetaza (IleRS) je enzim koji katalizira nastajanje izoleucil-tRNAIle u dva koraka; izoleucin se prvo aktivira uz pomoć ATP-a pa prenosi na tRNAIle . Enzim posjeduje modularnu građu s katalitičkom domenom koja je evolucijski najstarija. Izolacija samostojeće katalitičke domene zato predstavlja prvi korak u pripremi ancestralnih oblika. IleRS spada u skupinu drevnih i za život presudnih enzima što čini njegovu ancestralnu rekonstrukciju važnom za razumijevanje evolucije biosinteze proteina, ključnog staničnog procesa. U sklopu ovog diplomskog rada proizvedena su i kinetički okarakterizirana dva funkcionalno-minimalna (krnja) oblika IleRS2 iz bakterije Bacillus megaterium nastala uklanjanjem C-terminalne, korektivne i CP2 domene iz cjelovitog oblika. Topljivost krnjih oblika IleRS bila je niska što predstavlja veliki izazov za daljnja istraživanja. Kinetička karakterizacija pokazala je da oba krnja oblika posjeduju aminoacilacijsku aktivnost koja je 3-4 reda veličine manja nego kod cjelovite IleRS. Dobiveni rezultati ukazuju da su konstruirani krnji oblici IleRS2 dobri modeli za daljnje istraživanje ancestralnih oblika IleRS. Isoleucyl-tRNA synthetase (IleRS) catalyzes the formation of isoleucyl-tRNAIle in two steps; ATP-dependent isoleucine activation is followed by isoleucine transfer to the tRNAIle . The enzyme is modular with the catalytic domain being the most ancient. Hence, the isolation of a freestanding catalytic domain represents the first step in the design of IleRS ancestral forms. IleRS belongs to a group of ancient and life-essential enzymes whose ancestral reconstruction is relevant for understanding the evolution of protein biosynthesis, a key cellular process. Within this thesis, we prepared and kinetically characterized two functionally minimal (truncated) forms of IleRS2 from the bacteria Bacillus megaterium designed by omitting the C-terminal, editing, and CP2 domains. The solubility of these forms was low, representing a challenge for further research. Kinetic characterization showed that both forms are active with 3-4 orders of magnitude lower aminoacylation rates compared to full-length IleRS. Our results suggest these truncated forms are suitable models for further research of IleRS ancestral forms. |
