| Popis: |
Duchenne muscular dystrophy is the most severe form of muscular dystrophy. It is caused by frameshift mutations in dystrophin gene, which lead to the production of truncated, non-functional dystrophin protein. Treatment options for Duchenne muscular dystrophy are very limited and there is currently no cure. Cell therapies have great potential to treat the disease, but so far no efficient cell therapy has been developed. To contribute to overcoming the challenges that prevented previous attempts to develop such therapy from succeeding, we explored the possibilities of utilizing reprogramming and transdifferentiation strategies, combined with gene editing techniques, to prepare the cells that could restore dystrophin expression in two mouse models of Duchenne muscular dystrophy. The overall goal of our work was to generate high amount of genetically corrected myogenic, dystrophic mouse-derived cells that could be expanded extensively and would engraft well upon transplantation (back) to the dystrophic mouse. To this end, we utilized two different approaches for cell preparation. In the in vitro approach, we reprogrammed mouse embryonic fibroblasts, isolated from dystrophic mouse model, into induced myogenic progenitor cells. We then reversed the mutation in dystrophin gene utilizing CRISPR/Cas9 system and transplanted these genetically edited cells to the limb muscles of immunocompromised dystrophic mice. Despite successful gene editing and restoration of dystrophin expression in vitro, we were not able to detect any fibers with the restored dystrophin expression in vivo. In the in vivo approach, we reprogrammed dystrophic mouse-derived embryonic fibroblasts into induced pluripotent stem cells, corrected the mutation, and injected these cells into mouse blastocysts carrying two transgenes that allowed the ablation of blastocyst-derived satellite cells by administration of tamoxifen. Upon development of the injected blastocysts in the foster mother, newborn pups were injected with tamoxifen to ablate blastocyst-derived satellite cells and hence provide a niche for satellite cells derived from the injected induced pluripotent stem cells to proliferate. Based on the analysis of satellite cells, harvested from these mice, we concluded that contribution of induced pluripotent stem cells to the satellite cell niche in chimeric pups was too high to determine whether tamoxifen injections efficiently ablated blastocyst-derived satellite cells. However, high contribution of induced pluripotent stem cells to the satellite cell niche suggests that the amount of satellite cells obtained from the muscles of chimeric mice would likely be sufficient for efficient transplantation to dystrophic mouse regardless of tamoxifen administration. All in all, our work lays a good foundation for the potential development of cell therapy, based on the production of patient-derived, genetically edited myogenic cells in vitro or patient-derived, genetically edited satellite cells in animals such as pigs. V telesu odraslega človeka je približno 600 skeletnih mišic, ki predstavljajo približno 40 % telesne mase. Skeletne mišice nam omogočajo premikanje, pomagajo pri ohranjanju pokončne drže in skrbijo za termogenezo. Zaradi svoje fiziološke vloge se morajo neprenehno obnavljati oziroma regenerirati. Ključno vlogo pri obnovi skeletnih mišic imajo mišične tkivne matične celice, imenovane satelitne celice, ki so v času vzpostavljene tkivne homeostaze dormantne. Ob poškodbi ali bolezni, ki zahteva mišično regeneracijo, se satelitne celice aktivirajo, začnejo deliti in diferencirajo v mioblaste. Mioblasti se nadalje delijo in diferencirajo v miocite, ki nato še dodatno diferencirajo in se medsebojno povežejo v mišična vlakna, t.j. večjedrne celice, ki predstavljajo osnovno gradbeno enoto skeletnega mišičnega tkiva. Satelitne celice in mioblaste s skupnim imenom pogosto imenujemo mišične predniške celice, miociti in predvsem mišična vlakna pa predstavljajo diferencirane mišične celice. Za vsakega od celičnih tipov, ki so vključeni v mišično regeneracijo, je značilno povišano izražanje specifičnih transkripcijskih faktorjev in nekaterih drugih proteinov. Satelitne celice in mioblasti tako med drugim povišano izražajo transkripcijski faktor PAX7, medtem ko se v miocitih in mišičnih vlakinih izražanje tega proteina zniža. Za miocite in mišična vlakna je značilno povišano izražanje MYOD1, MYOG, MYH1 in nekaterih drugih proteinov, ki se v satelitnih celicah in mioblastih izražajo zelo nizko. Pri številnih boleznih mišic je mišična obnova ovirana. Najpogostejše med takšnimi boleznimi so mišične distrofije, za katere je značilno postopno slabljenje mišic in izgubljanje mišične mase. Duchennova mišična distrofija je najhujša oblika mišične distrofije. Vzrok za bolezen so različne mutacije v najdaljšem človeškem genu, DMD, ki spremenijo bralni okvir in s tem povzročijo nastanek skrajšane in nefunkcionalne oblike proteina DMD. Pomanjkanje DMD destabilizira povezavo med citoskeletom mišičnih celic in zunajceličnim matriksom, kar se odraža v slabljenju in izgubljanju mišičnih vlaken. Med mutacijami, ki vodijo v pojav bolezenskega fenotipa, se največkrat pojavljajo daljše delecije, dokaj pogoste pa so tudi duplikacije in točkovne mutacije. Mutacije se lahko pojavljajo v katerem koli od 79-ih eksonov gena DMD, a so najpogosteje med eksoni 45 in 55. Možnosti za zdravljenje bolezni so precej omejene samega zdravila zaenkrat še ne poznamo, so pa dostopne določene oblike farmakoterapije, predvsem v obliki kortikosteroidov, ki lajšajo simptome bolezni. V zadnjem času kot možno obliko zdravljenja bolezni znanstveniki preučujejo različne genske in celične terapije. Celične terapije imajo vsaj teoretično velik potencial za uspešno zdravljenje, a zaenkrat takšne, ki bi bila učinkovita tudi v praksi, ne poznamo. Večina preteklih poskusov razvoja celične terapije za Duchennovo mišično distrofijo je temeljila na alogeni transplantaciji mioblastov, ki pa se je zaradi izredno nizke učinkovitosti vgraditve mioblastov v mišično tkivo prejemnika, imunskega odziva na transplantirane celice in nezmožnosti mioblastov, da nadomestijo celice v niši satelitnih celic, v kliničnih raziskavah izkazala za precej neuspešno. Nekatere raziskave na živalskih modelih so pokazale, da bi dobro alternativo lahko predstavljala alogena presaditev satelitnih celic, vendar to do sedaj še ni bilo potrjeno v (kliničnih) raziskavah na ljudeh. Glavno oviro uporabe takšne terapije za človeka poleg možnosti imunskega odziva na donorske celice predstavlja dejstvo, da je satelitne celice zelo težko pridobiti v zadostnih količinah za transplantacijo. Ob gojenju satelitnih celic in vitro se namreč njihove lastnosti na molekularnem nivoju zelo spremenijo, poleg tega pa praktično takoj začnejo tudi diferencirati, zato je za uspešno transplantacijo nujno pridobiti zadostno količino svežih satelitnih celic in se izogniti njihovemu pomnoževanju in vitro. V okviru magistrske naloge smo želeli raziskati možnosti za celično terapijo, ki bi se izognila problemom, s katerimi so se srečevali dosedanji poskusi transplantacije satelitnih celic in mioblastov. Zanimalo nas je, ali je s pomočjo reprogramiranja in transdiferenciacije somatskih celic mogoče pripraviti avtologne celice z urejenim genomom, ki bi po transplantaciji omogočale povrnitev izražanja proteina DMD v živalskem modelu mišične distrofije. Naše raziskave so temeljile na dveh mišjih modelih mišične distrofije, Dmdmdx in Dmdmdx-4cv. Obema modeloma je skupno, da imata v genu Dmd točkovno mutacijo, ki povzroča nastanek prezgodnjega stop kodona in s tem prezgodnjo terminacijo translacije, kar vodi v nastanek skrajšanega in nefunkcionalnega proteina DMD. Točkovna mutacija se pri mišjem modelu Dmdmdx nahaja v eksonu 23, medtem ko ima mišji model Dmdmdx-4cv mutacijo v eksonu 53. Celice za transplantacijo smo pripravili na dva načina oziroma z dvema pristopoma. Pri in vitro pristopu smo uporabljali samo mišji model Dmdmdx-4cv, medtem ko smo pri in vivo pristopu uporabljali oba mišja modela. Glavni cilj obeh uporabljenih pristopov je bil iz fibroblastov distrofičnih miši pridobiti zadostne količine mišičnih (predniških) celic s popravljeno mutacijo v genu Dmd, ki bi jih bilo mogoče namnožiti in ki bi se po (avtologni) transplantaciji uspešno vgradile v mišično tkivo, nadomestile celice v niši satelitnih celic in pripomogle k povrnitvi izražanja proteina DMD. In vitro pristop za pripravo celic je temeljil na induciranih mišičnih predniških celicah, iMPC. Gre za mešano kulturo predniških in diferenciranih mišičnih celic, ki jih lahko pripravimo iz mišjih (embrionalnih) fibroblastov preko prekomernega izražanja transkripcijskega faktorja MYOD1 in sočasnega tretmaja s tremi molekulami z nizko molekulsko maso: forskolinom, RepSoxom in molekulo CHIR99021. Ker takšne celice do sedaj še niso bile pripravljene iz fibroblastov, pridobljenih iz distrofičnih miši, temveč samo iz fibroblastov, pridobljenih iz miši divjega tipa, nas je najprej zanimalo, ali je sploh mogoče pripraviti »distrofične« iMPC. Z uporabo nekoliko modificiranega postopka za pripravo iMPC iz fibroblastov divjega tipa smo iz embrionalnih fibroblastov distrofičnih miši uspeli pridobiti iMPC, kar smo potrdili tako na celičnem kot tudi na molekularnem nivoju z uporabo mikroskopije, qPCR in imunocitokemije. V naslednjem koraku smo v iMPC z uporabo sistema CRISPR/Cas9 popravili oziroma izničili učinek mutacije v genu Dmd. Uspešno ureditev genoma smo potrdili preko PCR in določanja nukleotidnega zaporedja na nivoju DNA in mRNA (cDNA). S pomočjo imunocitokemije smo potrdili, da so celice z urejenim genomom izražale protein DMD. iMPC z urejenim genom so obdržale morfologijo in molekularne značilnosti mišičnih celic vsaj do 17. pasaže, v kateri so bile v kulturi še vedno prisotne tudi mišične predniške celice. Na podlagi teh opažanj in na podlagi predhodnih raziskav z iMPC divjega tipa smo pričakovali, da se bodo iMPC z urejenim genomom po transplantaciji uspešno vgradile v mišice distrofičnih, imunoinkompetentnih miši in v njih povrnile izražanje DMD. V nasprotju s pričakovanji povrnitve izražanja DMD po transplantaciji nismo opazili, vendar pa je bilo zaradi ene same ponovitve poskusa nemogoče določiti, ali je bil takšen rezultat posledica neuspešne vgradnje iMPC z urejenim genomom v prejemniške mišice, smrti transplantiranih celic, ali pa je šlo zgolj za napako v eksperimentalnem postopku. In vivo pristop za pripravo celic je temeljil na induciranih pluripotentnih izvornih celicah, iPSC. V prvi stopnji smo embrionalne fibroblaste, izolirane iz distrofičnih miši s pomočjo prekomernega izražanja genov Pou5f1, Klf4, Sox2 in c-Myc reprogramirali v iPSC in jih okarakterizirali z mikroskopijo, qPCR in imunocitokemijo. V nadaljevanju smo v teh celicah z uporabo sistema CRISPR/Cas9 in njegove izpeljanke, tehnologije za urejanje genoma »prime«, popravili mutacijo v genu Dmd. Uspešno ureditev genoma smo na nivoju DNA potrdili s pomočjo PCR in določanja nukleotidnega zaporedja. Da smo uspešno ureditev genoma in posledično uspešno povrnitev izražanja DMD lahko potrdili še na nivoju mRNA in proteinov, smo iPSC, v katerih je izražanje DMD prenizko, da bi ga bilo mogoče zaznati, diferencirali v mišične celice in jih analizirali s pomočjo PCR, določanja nukleotidnega zaporedja in imunocitokemije. Z uspešno diferenciacijo v mišične celice smo dodatno potrdili tudi pluripotentno (oziroma vsaj multipotentno) naravo iPSC. iPSC z urejenim genomom smo nato injicirali v mišjo blastocisto z dvema transgenoma, ki sta ob administraciji tamoksifena omogočala sprožitev celične smrti v celicah, ki izražajo PAX7. Po razvoju blastociste z injiciranimi iPSC v nadomestni materi, smo v primeru blastocist, v katere smo injicirali iPSC z urejenim genomom, ki so bile pripravljene iz fibroblastov, izoliranih iz mišjega modela Dmdmdx, dobili zadostno število himernih potomcev za analizo. Z administracijo tamoksifena smo v novorojenih himernih miših poskusili povzročiti celično smrt vseh satelitnih celic, ki so izhajale iz blastociste in s tem ustvariti nišo za pomnoževanje satelitnih celic, ki so izhajale iz iPSC. Na podlagi primerjalne analize satelitnih celic, izoliranih iz mišic himernih miši, ki so prejele tamoksifen in himernih miši, ki tamoksifena niso prejele, smo ugotovili, da je bil doprinos iPSC k naboru satelitnih celic že v osnovi tako visok, da so praktično vse satelitne celice v himernih miših izvirale iz iPSC. Posledično ni bilo mogoče določiti, ali ima tamoksifen pričakovan učinek na satelitne celice, ki izhajajo iz blastociste. Po drugi strani se je uporaba tamoksifena ravno zaradi zelo visokega doprinosa iPSC k naboru satelitnih celic izkazala za brezpredmetno, saj bi bila količina satelitnih celic, ki so izhajale iz iPSC, v mišicah himernih miši zaradi visoke stopnje himerizma najverjetneje zadostna za uspešno transplantacijo v distrofično miš, ne glede na uporabo tamoksifena. Tako poskusi, izvedeni v okviru in vitro pristopa, kot tisti, izvedeni v okviru in vivo pristopa za pripravo celic, predstavljajo dobro podlago za razvoj avtologne celične terapije za zdravljenje ljudi z Duchennovo mišično distrofijo. Trenutno največjo oviro za uporabo iMPC pri ljudeh predstavlja pomanjkanje učinkovitih pristopov za pripravo človeških iMPC ali njim podobnih celic, medtem ko so postopki za pripravo človeških iPSC že optimizirani in je znano, da človeške iPSC ob injiciranju v prašičjo blastocisto doprinesejo k himerizmu. Po drugi strani je priprava himer med ljudmi in živalmi in uporaba živali za pripravo človeških celic in organov etično sporna, tako da bi bila s tega vidika uporaba iMPC bolj smiselna. |
