| Popis: |
Infectious diseases kill millions of people every year. Despite quickly evolving technology, vaccination remains the most efficient way to prevent and treat them in most regions of the world. Vaccines are based on the immunological memory of adaptive immune system. For achieving the most effective response of this part of immune system, a prior activation of innate immunity is required. In this process, dendritic cells (DC) represent the main connecting link between the two systems. DCs are professional antigen presenting cells (APCs), capable of antigen acquiring, processing and presenting it to T cells. Because of their important position in the activation of adaptive immune system, DCs represent an important target model for vaccine production. So far, most clinical studies have used these APCs for specific activation of cytotoxic T cells (CTLs), which are the only cells being able to completely eliminate viral infection. Recently, there a growing interest in using mRNA as a vaccine platform to activate DCs has evolved, mainly due to its favorable safety profile and ability to efficiently activate cell-mediated immune responses. Actually, mRNA-vaccines offer a compelling alternative in preventing and treating various infections, as they can be rather quickly produced, are transiently expressed and suitable for encoding different antigens. For these reasons, we set up to evaluate feasibility and efficiency of intranodal immunization of mice with mRNA-based vaccines in evoking antigen-specific T and B cell immune responses. For our experiments we used three mouse-models, HIV-1, LCMV and influenza A virus. Depending on the model, mRNAs were encoded with different viral antigens (HIVACAT, NP, gp and HA) and adjuvants (TriMix: CD40L, CD70 and caTLR4 DiMix: CD40L and caTLR4 and flagellin). We demonstrated that intranodal immunization of mice with mRNA-vaccines can generate strong antigen-specific T-cell and B-cell immune responses. With a concomitant application of the TriMix mRNA we achieved stronger CTL responses following the first and the second, but not after the third immunization. In contrast, flagellin enhanced humoral immune responses to influenza hemagglutinin (HA) but turned to be immunosuppressive in regard of CTL activation. Our preliminary experimental results are only a small contribution to the complex field of mRNA-vaccines development, but they suggest that by continuing research in this direction the efficiency of fighting various types of life-threatening diseases could be improved in future. Kljub hitremu tehnološkemu napredku na številnih podočjih ostaja cepljenje najučinkovitejši pristop za preprečevanje infekcijskih bolezni, ki letno terjajo milijone življenj po svetu. Cepiva temeljijo na imunskem spominu celic pridobljene imunosti. Za popoln oz. obsežen odziv tega dela imunoskega sistema pa je potrebna ustrezna predhodna aktivacija celic prirojene imunosti. Pri tem predstavljajo dendritične celice (DC) poglavnitno povezavo med naravno in pridobljeno imunostjo. Gre za profesionalne antigene predstavitvene celice (APC), sposobne privzemati antigenske proteine, jih razgraditi v peptide in nato, vezane na molekule poglavitnega kompleksa tkivne skladnosti (MHC), predstaviti T-celičnim receptorjem na limfocitih T. Potem ko se antigenski peptide vežejo na molekule MHC razreda I, jih lahko prepoznajo T-celični receptorji (TCR), izraženi na določenih klonih citotoksičnih CD8+ limfocitov T (CTL), ki imajo osrednjo vlogo pri odstranjevanju z virusi okuženih in rakavo spremenjenih celic. Antigenske peptide, ki se vežejo na molekule MHC razreda II, pa specifično prepoznavajo TCR, prisotni na ustreznih klonih CD4+ T celic pomagalk (celice Th). Celice Th so pomembne tako za dozorevanje in proliferacijo ter okrepitev delovanja CTL (preko DC), kot tudi za proizvodnjo visoko afinitetnih antigensko specifičnih protiteles v plazmatkah. Zaradi velikega vpliva, ki ga imajo DC na pridobljeni imunski odziv, predstavljajo pomemben model za izdelavo cepiv. Do sedaj so jih v večini kliničnih testiranj uporabili z namenom aktivacije imunskega sistema pri infekcijskih boleznih in različnih oblikah raka. Cilj je bil predvsem aktivacija specifičnih citotoksičnih odzivov CLT, saj lahko le ti popolnoma odstranijo z virusi okužene ali rakavo spremenjene celice. V zadnjem času se je zaradi njenega varnostnega profila in sposobnosti aktivacije celičnega imunskega odziva močno povečalo zanimanje za uporabo mRNA-cepiv. V primerjavi z drugimi dostavnimi sistemi antigenov se je namreč ta, zaradi svoje prehodne ekspresije v citosolu, možnosti vkodiranja različnih antigenskih proteinov ter hitre izdelave, pokazal kot zanimiva možnost v boju proti različnim povzročiteljem okužb. Namen naše magistrske naloge je bil preučiti izvedljivost in učinkovitost intranodalne imunizacije z mRNA, kodirane z različnimi antigeni in adjuvanti, s ciljem aktivacije antigensko specifičnih T- in B- celičnih imunskih odzivov pri različnih okužbah in vivo. Dokazali so namreč, da so DC v bezgavkah sposobne privzemati mRNA, izraziti kodirane antigenske proteine, jih v obliki peptidov predstaviti v kontekstu molekul MHC in uspešno aktivirati celični imunski odziv. Pri našem delu smo uporabili 3 mišje modele, in sicer HIV-1, LCMV in influenca A. V mRNA smo vkodirali različne antigene, glede na uporabljeni model, in sicer skupaj z različnimi adjuvanti TriMix (CD40L, CD70, caTLR4), DiMix (CD40L, caTLR4) in flagelin. Adjuvante smo uporabili zato, ker določajo učinkovitost cepiva oz. njegovo sposobnost aktivacije DC. Mišji model virusa človeške imunske pomanjkljivosti 1 (HIV-1) Razvoj protiretrovirusnega zdravljenja v zadnjih letih je zagotovil novo upanje za osebe, ki so okužene s HIV-1. Kljub učinkovitosti pa tovrstno zdravljenje ni kurativno, zato je vseživljenjsko, spremljajo pa ga pogosti neželeni učinki, bolniki pa so tudi bolj dovzetni za srčnožilne in nevrološke bolezni. Zaradi osrednje vloge imunskega sistema pri okužbi z virusom HIV-1, bi lahko bila imunoterapija pomembna nova metodo za premagovanje te bolezni. Odločili smo se, da bomo v mRNA kodirali ohranjena strukturna področja virusa HIV-1 (struktura HIVACAT), za katere je znano, da so tarče T-celičnega imunskega odziva v obolelih osebah z nizko plazemsko koncentracijo virusa. V bezgavkah in vranici poskusnih živalih smo, po prvi, drugi in tretji imunizaciji s cepivoma HIVACAT mRNA in HIVACAT mRNA + TriMix, ugotavljali obseg specifičnega citotoksičnega odziva CD8+ limfocitov T. Ugotovili smo, da je vsaka imunizacija povečala omenjeni imunski odziv. Prisotnost adjuvanta TriMix je pripomogla k močnejšemu odzivu CTL po prvi in drugi imunizaciji, v primerjavi s skupino živali, ki je prejela cepivo brez njega. Po tretji aplikaciji pa so razlike med primerjanima skupinama postale manjše. Ob tem smo preverili tudi morebiten vpliv strukture TriMix na obseg in jakost T-celičnih odzivov na 17 strukturnih področij HIV-1, kodiranih v strukturi HIVACAT, pri čemer nismo opazili večjih razlik, v primerjavi s skupino živali, ki je prejela zgolj cepivo HIVACAT mRNA. ii) Mišji model virusa limfocitnega horiomeningitisa (LCMV). Mišji model LCMV se zaradi podobnega vpliva na imunski sistem, kot ga ima HIV-1, pogosto uporablja za odkrivanje imunskih lastnosti slednjega. Dva poglavitna strukturna proteina v LCMV, ki sta odgovorna za citotoksični T-celični imunski odziv nanj, sta nukleoprotein in glikoprotein. Zato smo v mRNA vkodirali oba, in sicer v kombinaciji z različnimi adjuvantnimi imunostimulatornimi molekulami (TriMix, DiMix in flagelin). Analizirali smo jakost imunskih odzivov CTL na oba antigenska proteina, in sicer glede na dodani adjuvant. V vseh primerjanih skupinah poskusnih živali smo določili močne odzive, s čimer smo potrdili visoko imunogenost obeh antigenskih proteinov (nukleoproteina in glikoproteina). Ugotovili smo, da je bil pri tem TriMix najučinkovitejši adjuvant, flagelin pa je deloval imunsupresivno na aktivacijo CTL. Mišji model virusa influence A Na koncu smo preverili, kakšen vpliv imajo mRNA-cepiva na humoralni imunski odziv. Želeli smo ugotoviti, ali intranodalna imunizacija z mRNA lahko izzove protitelesni imunski odziv proti hemaglutininu virusa influence A, in ali ga lahko z dodatkom adjuvantov še povečamo. V plazmi imuniziranih poskusnih živali smo skozi daljše časovno obdobje določali protitelesa IgG1 in IgG2a. Medsebojno smo primerjali tudi različne skupine živali, ki so prejele cepivo z različnimi adjuvanti (TriMix, DiMix in flagelin). Najučinkovitejši adjuvant je bil flagelin, TriMix pa je zaviral na humoralni imuski odziv. Za podrobnejšo analizo smo uporabili različne kombinacije imunostimulatornih adjuvantnih molekul (CD40L, CD70, caTLR4, flagelin), da bi lahko ocenili vpliv posamezne od njih. Tiste skupine živali, pri katerih je bil v cepivu prisoten flagelin, so izkazale obsežnejše B-celične oz. humoralne imunske odzive glede na tiste, pri katerih tega adjuvanta nismo uporabili. Nasprotno pa smo pri živalih, pri katerih so bile v uporabljenem cepivu kodirane adjuvantne molekule CD70, opazili njihov imunosupresiven učinek na B-celični imunski odziv. Dokazali smo torej, da intranodalna imunizacija z mRNA-cepivi izzove T- in B-celične imunske odzive. S sočasno uporabo adjuvanta TriMix smo dosegli povečanje citotoksičnega odziva CD8+ limfocitov T po prvi in drugi, ne pa tudi po tretji imunizaciji. Flagelin je povečal humoralni odziv, na T celični odziv pa je deloval imunosupresivno. Naši preliminarni eksperimentalni rezultati predstavljajo le majhen prispevek v okviru kompleksnega razvoja mRNA-cepiv, vandar pa nakazujejo, da bi lahko z nadaljnjih delom v tej smeri pripomogli k učinkovitejšem boju proti različnim vrstam življenja ogrožajočih okužb. |
