Identification and characterization of differentially expressed proteins by Escherichia coli O157:H7 strains with hypervirulence phenotype from Argentine cattle

Autor: Amigo, Natalia Loreley
Přispěvatelé: Cataldi, Angel A.
Jazyk: Spanish; Castilian
Rok vydání: 2017
Předmět:
Zdroj: Biblioteca Digital (UBA-FCEN)
Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
instacron:UBA-FCEN
Popis: Escherichia coli O157:H7 es un patógeno zoonótico de importancia mundial, capaz de causar diarrea severa y síndrome urémico hemolítico (SUH) en humanos. El SUH es una enfermedad epidémica de baja tasa de incidencia en países industrializados. Sin embargo, Argentina es el país de mayor incidencia mundial, con 12-14 casos cada 100.000 en menores de 5 años y con 400 nuevos casos por año en la última década. El ganado bovino es su principal reservorio y fuente de infección. E. coli O157:H7 se caracteriza por poseer varios factores de virulencia, entre ellos, el más importante es la toxina Shiga (Stx), necesaria para el desarrollo del SUH, que puede ser de tipo 1 y/o de tipo 2, y esta última a su vez de varios subtipos. Otro de sus factores de virulencia, es el Sistema de Secreción de Tipo Tres (SSTT), codificado en la isla de patogenicidad LEE. El SSTT trasloca factores de virulencia en las células epiteliales; llamados efectores, produciendo una lesión histopatológica conocida como attaching and effacing, caracterizada por la íntima adherencia al enterocito y la eliminación de las microvellosidades intestinales. Otros factores de virulencia se encuentran en el plásmido pO157; pero de sus 100 genes putativos, solo 19 han sido caracterizados. Diversos estudios epidemiológicos sugieren una correlación entre el pO157 y la progresión de la diarrea al SUH. Por SNPs typing se han definido nueve clados de E. coli O157:H7, siendo las cepas de clados 6 y 8 las más frecuentemente asociadas a diarrea severa y SUH. La mayoría de las cepas de clado 8 poseen dos subtipos de Stx2; Stx2a y Stx2c, con una mayor expresión de Stx2 que otros clados, lo que contribuye a la hipervirulencia del clado 8. Se ha observado que las cepas de clado 8 son altamente predominantes, en el ganado y en los casos de SUH en Argentina. En este trabajo, se estudiaron ocho aislamientos seleccionados al azar de E. coli O157:H7 procedentes del ganado de Argentina, así como dos cepas de casos clínicos humanos. Fue posible demostrar, por el análisis de 23 de SNPs que 4 cepas aisladas de bovinos fueron clasificadas como clado 8 así como también 2 cepas aisladas de humanos, mientras que otras dos cepas bovinas fueron clasificadas como clado 6, también descripto como hipervirulento. Luego de clasificarlas se procedió a evaluar la patogenicidad en relación a la producción de toxina Shiga, lisis de glóbulos rojos in vitro dependiente del SSTT, ensayos de adherencia en cultivos celulares, inhibición de la absorción normal de agua en explantos de colon humano y análisis de morbilidad y letalidad en ratones BALB/c. Cuatro de las cepas bovinas mostraron una alta producción de Stx y una de ellas, la cepa 7.1 Anguil, mostro alta actividad Verocitotóxica en cultivos celulares y una fuerte inhibición de la normal absorción de agua en explantos de colon humano, en relación a la cepa E. coli O157:H7 EDL933. Dos cepas, Rafaela II y 7.1 Anguil, presentaron altos niveles de lisis en eritrocitos, altos niveles de producción de Stx2 y fueron asociadas con una alta letalidad y morbilidad en el modelo murino ensayado. Por los resultados obtenidos en los ensayos de virulencia realizados tanto in vitro, ex vivo como in vivo, fueron seleccionadas la cepa Rafaela II (clado 8, bovina) y la cepa 7.1 Anguil (clado 6, bovina), como candidatas para el posterior análisis genómico y proteómico comparativo, con la cepa EDL933 (cepa de referencia, clado 3). Fue realizada la secuenciación de los genomas de estas cepas. En ambas se detectó el plásmido pO157, y en la cepa 7.1 Anguil se detectó un plásmido adicional con alta homología con el plásmido pChi7122-3 de la cepa aviar APEC E. coli 7122 (O78:K80:H9). Fueron predichos los genes de cada cepa, obteniéndose 5,643 para 7.1 Anguil y 5,439 para la cepa Rafaela II, respectivamente. Esta información fue utilizada para comparar los contenidos de los genes, y para la obtención de genes compartidos y únicos, utilizando las cepas TW14359 y EDL933 como referencias. La comparación de los genes compartidos mostró una relación filogenética de la cepa Rafaela II, estrechamente relacionada a la cepa de referencia TW14359, ambas clado 8. Estos resultados son consistentes con el análisis de SNPs previamente realizado. El análisis proteómico cuantitativo, fue centrado en las proteínas sobreexpresadas que podrían estar relacionadas con la virulencia. Las proteínas que se sobreexpresaron en E. coli O157:H7 Rafaela II fueron, la proteína del curli CsgC, un activador transcripcional (PchE), las proteínas de fagos, Stx2, FlgM y FlgD, CheY, CheW, una dienelactona hidrolasa y la proteasa EspP, estas últimas dos codificadas en el plásmido pO157, entre otras. Para la cepa 7.1 Anguil, se detectó una alta sobreexpresión de las proteínas de fagos, sobre todo las codificadas en el fago Stx2a, incluyendo Stx2; también una flagelina y la proteasa TagA, EDL933_p0016, dienelactona hidrolasa, y hemolisina HlyA, cuyas últimas cuatro están codificadas en el pO157. Estas proteínas fueron detectadas como sobreexpresadas entre 4 y 16 veces más en las cepas Rafaela II y 7.1 Anguil comparadas con EDL933. Luego se seleccionaron 12 proteínas, por los mismos criterios de búsqueda y selección, para su validación por RTq-PCR. Se demostró un aumento en la transcripción en 10 de los 12 genes analizados. De este modo, la concordancia entre los resultados de la proteómica y los resultados de RTq-PCR fue aceptable. De esas 10 proteínas, se eligieron seis como candidatas a la obtención de mutantes, poniendo especial énfasis en aquellas proteínas poco estudiadas, posibles factores de virulencia y sobreexpresadas en ambas cepas y/o ambas fracciones. Así fueron seleccionados el activador transcripcional PchE presente en clado 8; la hemolisina HlyA; la proteasa TagA, la proteína de fago EDL1403, con el mayor fold change (16,45) detectado en este trabajo y con un dominio de adaptación de respuesta sensorial quinasa; la proteasa EspP, sobreexpresada en ambas cepas; y Stx2a, uno de los principales factores de virulencia de E. coli O157:H7, sobreexpresada en ambas cepas. Se incluyó a la cepa 125/99 para la mutación de Stx2, por ser clado 8, por poseer una sola copia del gen stx2, no poseer stx1 y por estar incluida entre las cepas más virulentas en los ensayos realizados. Se obtuvieron mutantes para el gen stx2 en la cepa 125/99 y se analizó su rol tanto en el ensayo de citotoxicidad como en el de patogenicidad en el modelo murino. Los resultados obtenidos demuestran que la mutación de stx2 elimina la expresión de Stx2, provocando la anulación del fenotipo asociado, la muerte celular por apoptosis observada en células Vero. En ratones BALB/c se observó que la mutación de stx2 elimina la expresión de Stx2, provocando la disminución de la patogenicidad observada en ratones, sin registrarse letalidad en los animales inoculados con la cepa 125/99Δstx2, Debido a la dificultad en la obtención de mutantes en los otros genes para las cepas bovinas, se implementó la eliminación del plásmido pO157, ya que codifica para tres de los genes candidatos, hlyA, espP y tagA. Se obtuvieron mutantes para las cepas Rafaela II y 7.1 Anguil, para la eliminación del pO157 y se analizó su rol en la virulencia en el modelo murino de infección. Los resultados obtenidos muestran que la eliminación del plásmido pO157 disminuye la virulencia en la cepa 7.1 Anguil provocando la anulación del fenotipo observado de morbilidad y letalidad en BALB/c, ya que no se registró letalidad en el modelo murino con la cepa 7.1 Anguil ΔpO157. Sin embargo, en la cepa Rafaela II, la eliminación de pO157 no disminuyó su virulencia, ya que los valores de patogenicidad y letalidad observados en BALB/c fueron los mismos tanto para la cepa Rafaela II como para la cepa Rafaela IIΔpO157. Estos resultados nos permitieron demostrar una alta virulencia en las cepas de clado 8 y clado 6 aisladas de bovinos argentinos y concluir en consecuencia que la circulación de tales cepas en el ganado puede contribuir en parte a la alta incidencia de SUH en Argentina. Este trabajo nos permite asociar los resultados de la proteómica cuantitativa con los hallazgos previos de virulencia y patogenicidad en modelos in vitro, ex vivo y en el modelo in vivo, en el ratón. Comprender y analizar la medida en que estos y otros factores contribuyen a la virulencia completa de E. coli O157:H7 clado 8 y clado 6 requerirá de mayores y futuras investigaciones. Estos avances, apoyados en estudios bioinfomáticos, nos han permitido identificar nuevos y potenciales factores de virulencia que permitirán comprender características de la virulencia de E. coli O157:H7 en general y de los clados hipervirulentos 6 y 8 en particular. Estos resultados pueden proporcionar nuevas perspectivas en los mecanismos de patogénesis de E. coli O157:H7. Escherichia coli O157: H7 is a zoonotic pathogen of global importance, capable of causing severe diarrhea and hemolytic uremic syndrome (HUS) in humans. HUS is an epidemic disease of low incidence rate in industrialized countries. However, in Argentina, the country with the highest incidence in the world, with 12-14 cases per 100,000 children less than 5 years with about 400 cases reported each year in the last decade. Cattle are the main reservoir and source of infection. E. coli O157:H7 is characterized by the presence of several virulence factors, including Shiga toxin (Stx) necessary for the development of HUS, its most important virulence attribute, which may be type 1 and/or type 2, and the latter has several subtypes. Another virulence factors is the System Type Three Secretion (TTSS), encoded in the pathogenicity island LEE. The TTSS translocate virulence factors called effectors in epithelial cells; producing a histopathological lesion known as attaching and effacing, characterized by the close adherence to enterocytes and removal of intestinal microvilli. Other virulence factors are in the plasmid pO157; but its 100 putative genes, only 19 have been characterized. Epidemiological studies suggest a correlation between pO157 and progression of diarrhea to HUS. Nine clades were defined in E. coli O157:H7 strains by SNP typing, being clades 6 and 8 most frequently associated with severe diarrhea and HUS. Most strains of clade 8 have two subtypes Stx2; Stx2a and Stx2c, with increased expression of Stx2 compared to other clades, contributing to hypervirulence of clade 8. It was observed that the clade 8 strains are highly prevalent in cattle and HUS cases in Argentina. In this work, eight randomly selected isolates of E. coli O157:H7 from cattle in Argentina, as well as two strains of human clinical cases were studied. It could be demonstrated by 23 SNP analyses that 4 strains isolated from cattle were classified as clade 8 as well as two human strains, while two other bovine isolates were closely related to the clade 6, also described as hypervirulent. The pathogenicity was evaluated by Shiga toxin production, in vitro red blood cell lysis dependent of TTSS, adhesion assays in cell lines, inhibition of normal water absorption in explants of human colon and morbidity and mortality analysis in BALB/c mice. Four bovine strains showed high production of Stx and one of them, the strain 7.1 Anguil, showed high verocytotoxic activity in cell cultures. Two strains, 7.1 Anguil and Rafaela II, showed high levels of lysis of erythrocytes. 7.1 Anguil strain also showed a strong inhibition of normal water absorption explants in human colon, respect to the E. coli strain O157:H7 EDL933. The two strains, Rafaela II and 7.1 Anguil, which showed high levels of production of red blood cell lysis and Stx2, were associated with high mortality and morbility in the murine model tested. From these results, both Rafaela II strain (clade 8 bovine) and 7.1 Anguil strain (clade 6 bovine) were selected, as candidates for the post-genomic analysis and quantitative comparative proteomics, with the strain EDL933 (standard strain, clade 3). The genomes of these isolates were sequenced. In both the plasmid pO157 was detected, and in the strain 7.1 Anguil an additional plasmid was detected with high homology with the pChi7122-3 plasmid of the avian E. coli strain APEC 7122 (O78:K80:H9). Genes were predicted in both strains, yielding 5,643 for 7.1 Anguil and 5,439 for Rafaela II strain, respectively. This information was used to compare the contents of the genes, and to obtain shared and unique genes, using TW14359 and EDL933 strains as references. Comparing shared genes showed a closely related phylogenetic relationship of Rafaela II strain to the reference strain TW14359, both clade 8. These results are consistent with the analysis of SNPs previously made. The quantitative proteomic analysis was focused on the overexpressed proteins that could be related to virulence. Proteins were overexpressed in E. coli O157:H7 Rafaela II were, curli CsgC protein, the transcriptional activator PchE, phage proteins, Stx2, FlgM and FlgD, CheY, CheW, a dienelactone hydrolase and protease EspP, these last two encoded in plasmid pO157, among others. For strain 7.1 Anguil, a high overexpression of the phage proteins, particularly those encoded in the phage stx2a including Stx2a, flagellin and TagA protease, EDL933_p0016, dienelactone hydrolase and hemolysin HlyA were detected, these last four are located in the pO157. These proteins were detected between 4 and 16 times more expressed in Rafaela II and 7.1 Anguil compared EDL933. Twelve proteins were then selected, based on the same criteria and selection for validation by RT-qPCR. An increase in transcription was demonstrated in 10 of the 12 genes analyzed. Thus, the agreement between the results of proteomics and the results of RT-qPCR was acceptable. Of those 10 proteins, six were selected as candidates for obtaining mutants under the aforementioned criteria, and with particular emphasis on those proteins little studied to as being potential virulence factors and overexpressed in both strains and/or both fractions. Thus, the selection consisted on: the transcriptional activator PchE, present in clade 8; the hemolysin HlyA; the TagA protease, the EDL1403 phage protein, with the largest fold change (16,45) detected in this work and with a domain adaptive sensory response kinase; the EspP protease overexpressed in both strains; and Stx2, one of the major virulence factors of E. coli O157:H7, overexpressed in both strains. The 125/99 strain was included for mutation of Stx2, for being clade 8, and possessing a single copy of the gene stx2, not have stx1 and being included among the most virulent strains in assays. Gene mutants for stx2 were obtained in strain 125/99 and its role tested in the cytotoxicity assay. The results show that the stx2 mutation eliminated the Stx2 expression, causing the annulment of the associated phenotype, cell death by apoptosis. Due to the difficulty in obtaining mutants in the other genes for the bovine strains, the elimination of plasmid pO157 was implemented as it encodes three of the candidate genes, hlyA, espP and tagA. Mutants for Rafaela II strains and 7.1 Anguil were obtained for eliminating pO157 and their role in virulence was tested in the murine model of infection, along with strain 125/99Δstx2. The results obtained show that the elimination of the pO157 plasmid decreases the virulence in the 7.1 Anguil strain, causing the annulment of the associated phenotype of morbidity and lethality in BALB/c, as well as in the strain 125/99Δstx2, with which no lethality was also recorded in the murine model assayed. However, in the Rafaela II strain, removal of pO157 did not decrease its virulence, as the pathogenicity and lethality values observed in BALB/c were the same for the Rafaela II strain as for Rafaela IIΔpO157 strain. These results allowed us to demonstrate high virulence strains of clade 8 and clades 6 isolated and therefore conclude that the circulation of such strains in cattle can contribute in part to the high incidence of HUS in Argentina. This work allows us to associate the results of quantitative proteomics with previous findings of virulence and pathogenicity in in vitro assays, ex vivo models and in vivo model in mice. To understand and analyze the extent to which these and other factors contribute to full virulence in clade 8 and clade 6 E. coli O157:H7 require further research. These studies supported by bioinformatics advances have allowed us to identify new and potential virulence factors that allow us to understand some characteristics of the virulence of E. coli O157:H7 in general and hypervirulent clades 6 and 8 in particular. These results may provide new insights into the mechanisms of pathogenesis of E. coli O157:H7. Fil: Amigo, Natalia Loreley. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.
Databáze: OpenAIRE
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