O patossistema begomovírus e mosca-branca em tomateiro : relato de uma nova espécie e controle do vetor Bemisia tabaci

Autor: Martins, Thais Pereira
Přispěvatelé: Nagata, Tatsuya
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2021
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da UnB
Universidade de Brasília (UnB)
instacron:UNB
Popis: Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2021. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). As lavouras de tomateiro são altamente afetadas por doenças causadas pelos vírus do gênero Begomovirus que têm causado um grande impacto nas principais regiões produtoras devido à falta de métodos de controle eficientes. Os begomovírus apresentam alta variabilidade genética, favorecendo o surgimento de novas variantes com potencial de causar prejuízos drásticos. Em uma visita de rotina a uma lavoura de tomateiro rasteiro em Luziânia, Goiás, uma planta de tomateiro (cv. AP533, suscetível à infecção por begomovírus) chamou a atenção por apresentar sintomas severos, caracterizado por folhas com manchas cloróticas e deformação foliar. Um novo begomovírus foi identificado nesta planta a partir da análise com a tecnologia Nanopore. A sequência do genoma completo foi determinada e confirmada por sequenciamento Sanger. O DNA-A do novo begomovírus, tentativamente nomeada como tomato begomovirus MoLDi (ToMoLDiV), apresentou maior identidade de nucleotídeos com tomato golden leaf distortion virus (81,65%; ToGLDV; acesso HM357456), confirmando o isolado como potencial novo membro do gênero. A organização genômica é típica de um begomovírus do novo mundo. A sequência conservada do nonanucleotídeo geminiviral e os sítios de ligação da Rep (iterons) foram identificados em ambos os segmentos. Filogeneticamente, o ToMoLDiV está mais próximo aos begomovírus ToGLDV, tomato mosaic severe dwarf virus (ToMSDV) e tomato interveinal chlorosis virus 2 (ToICV2). A agroinoculação do clone dimérico do componente DNA-A (C16A) resultou na detecção do DNA-A em 12 de 103 plantas das espécies Solanum lycopersicum cv. Santa Clara e cv. Lanai, Nicotiana tabacum cv. Samsun, N. rustica e Nicandra physaloides. Entretanto, não foram observados sintomas nessas plantas, indicando que o clone infeccioso do DNA-B será necessário para o cumprimento dos postulados de Koch. O vírus ToMoLDiV foi encontrado em uma lavoura onde já foi registrada a ocorrência dos begomovírus tomato severe rugose virus (ToSRV) e ToICV2, evidenciando uma rica diversidade de espécies de begomovírus nessa região produtora. O surgimento de novas variantes de begomovírus também pode ser favorecido pelas altas populações de moscas-brancas Bemisia tabaci que persistem nos campos devido ao desenvolvimento de resistência aos princípios químicos utilizados para seu controle. Muitos grupos de pesquisa têm investigado métodos alternativos de manejo desses insetos e o RNA interferente (RNAi) tem mostrado seu potencial no controle dessas pragas, apesar da atividade de RNases inespecíficas. Aqui, avaliamos os efeitos em moscas-brancas da ingestão de dsRNAs (fita dupla de RNA) contra os genes que codificam as proteínas Loquacious (LOQ), HSP70, Distroglicana (DIS), Tuberina (TUBE) e Laminina (LAMI). Foi verificado que a expressão de Loquacious e HSP70 é maior em estádios ninfais da mosca- 6 branca, porém, como a realização de ensaios de alimentação em dieta artificial com ninfas é inviável, manteve-se a avaliação do silenciamento de todos os genes em adultos. Os bioensaios utilizando dsRNA de tomato mosaic virus (ToMV) comercial (controle negativo) confirmaram a presença de compostos tóxicos às moscas-brancas nos lotes de dsRNAs comerciais, então optou-se por avaliar o silenciamento dos genes-alvo com administração de dsRNAs produzidos in vitro no laboratório. Os ensaios foram realizados basicamente com uma solução de sacarose (SAC) a 30% como dieta artificial. Nos testes com a ingestão de dsLOQ-B, dsTUBE, dsDIS, dsLAMI e dsHSP70-B, nenhum tratamento resultou em taxas de letalidade relevantes em relação aos controles. Porém, uma diferença significativa entre as curvas de sobrevivência dos tratamentos dsLAMI em relação a dsToMV foi observada, indicando possível efeito negativo da ingestão de dsLAMI. A quantificação da expressão de Laminina nas moscas-brancas após 120 horas de ensaio mostrou uma expressão em dsLAMI significativamente mais baixa em relação ao tratamento SAC. Apesar da tendência à letalidade observada após a ingestão de dsLAMI, o uso dos dsRNAs contra os genes-alvo avaliados com abordagens mais complexas, como a expressão em plantas transgênicas, ainda não é indicado. Foi verificada baixa de letalidade após a ingestão de dsHSP70-B, ao contrário dos ensaios já relatados. Portanto, será necessária a avaliação da degradação do dsRNA no intestino das moscas-brancas e do uso dos dsRNAs para genes-alvo associados à dsRNAs contra as RNases responsáveis pela degradação, para aumentar a eficiência do silenciamento visando induzir maior letalidade nas moscas-brancas. Tomato crops are highly affected by diseases caused by viruses of the genus Begomovirus, which cause great impacts on the major tomato producing regions due to the lack of efficient control methods. Begomoviruses present a high genetic variability that favours the emergence of new variants with the potential to cause drastic damages. In a routine visit to a processing tomato field in Luziânia, Goiás, a tomato plant cv. AP533 (susceptible to begomovirus infections) presented severe symptoms characterized by chlorotic spots and leaf deformation. A new begomovirus was identified in this plant by sequence analysis using the Nanopore technology. The complete genome sequence was determined and confirmed by Sanger sequencing. The DNA-A of the new begomovirus, tentatively named as tomato begomovirus MoLDi (ToMoLDiV), showed the highest nucleotide identity with tomato golden leaf distortion virus (81.65%; ToGLDV; accession HM357456), confirming the isolate as a potential new member of the genus. The genomic organization is typical of a New World begomovirus. The conserved geminiviral nonanucleotide sequence and Rep binding sites (iterons) were identified in both segments. Phylogenetically, ToMoLDiV is closer to the begomoviruses ToGLDV, tomato mosaic severe dwarf virus (ToMSDV) and tomato interveinal chlorosis virus 2 (ToICV2). Agroinoculation of the dimeric clone of the DNA-A component (C16A) resulted in the detection of DNA-A in 12 of 103 plants, including Solanum lycopersicum cv. Santa Clara and cv. Lanai, Nicotiana tabacum cv. Samsun, N. rustica and Nicandra physaloides. However, no symptoms were observed in the plants, thus the infectious clone of DNA-B will be necessary to fulfil Koch's postulates. The ToMoLDiV virus was found in a field where the occurrence of begomoviruses tomato severe rugose virus (ToSRV) and ToICV2 has been recorded, indicating a rich diversity of begomoviruses in this producing region. The emergence of these new variants can also be favoured by the high populations of Bemisia tabaci whiteflies that persist in the fields due to the development of resistance to the chemical compounds used for their control. Several research groups have investigated alternative methods of handling these insects and RNA interference (RNAi) has shown its potential for pest control, despite the activity of nonspecific RNases. Here, we evaluated the effects of dsRNA ingestion in whiteflies against genes encoding Loquacious (LOQ), HSP70, Dystroglycan (DIS), Tuberin (TUBE) and Laminin (LAMI) proteins. We verified that the expression of Loquacious and HSP70 is higher in whitefly nymphal stages, however, as performing feeding trials in artificial diet with nymphs is not feasible, the evaluation of the silencing effect of the two genes in adults was carried out instead. Bioassays using commercial dsRNA of tomato mosaic virus (ToMV) (negative control), demonstrated 8 the presence of toxic compounds to whiteflies in commercial dsRNA batches, so it was decided to evaluate the target gene silencing with the administration of dsRNAs produced in the laboratory. Tests were carried out with a 30% sucrose solution (SAC) as artificial diet. In tests with ingestion of dsLOQ-B, dsTUBE, dsDIS, dsLAMI and dsHSP70-B, no treatment resulted in relevant lethality rates compared to controls. However, significant differences between the survival curves of the dsLAMI treatment in relation to dsToMV was observed, indicating a possible negative effect of dsLAMI ingestion. The quantification of Laminin expression in whiteflies after 120 hours of testing showed a significantly lower expression in dsLAMI compared to the SAC treatment. Despite the trend towards lethality observed after ingestion of dsLAMI, the use of dsRNAs against target genes evaluated with more complex approaches, such as expression in transgenic plants, is still not indicated. Low lethality was observed after ingestion of dsHSP70-B, as opposed to already reported assays. Consequently, it will be necessary to evaluate the degradation of dsRNA in the intestine of whiteflies and the use of dsRNAs for target genes associated with dsRNAs against the RNases responsible for degradation, to increase the efficiency of silencing in order to induce greater lethality in whiteflies.
Databáze: OpenAIRE
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