Human visceral leishmaniasis antibody sensing employing peptide-based bioanalytical platforms supported by chemometric approaches

Autor: Mancini, Rodrigo Silva Nascimento
Přispěvatelé: Alves, Wendel Andrade, Lanfredi, Alexandre José de Castro, Angelucci, Camilo Andrea, Kubota, Lauto Tatsuo, Paixão, Thiago Regis Longo Cesar da
Rok vydání: 2022
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da UFABC
Universidade Federal do ABC (UFABC)
instacron:UFABC
Popis: Orientador: Prof. Dr. Wendel Andrade Alves Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, Santo André, 2022. A leishmaniose visceral humana (HVL) é uma importante doença tropical negligenciada que causou 90.000 mortes com cerca de 12 milhões de pessoas afetadas em todo o mundo em 2020. Como as terapias para esta doença são muito agressivas, o diagnóstico precoce é essencial. Entretanto, os métodos de detecção existentes ou utilizam procedimentos complexos com insumos de alto custo, ou necessitam de instrumentação especializada. Por esta razão, as tendências recentes de biossensores envolvem o desenvolvimento de novas plataformas que utilizam os anticorpos produzidos pela resposta humoral. E com o emprego de métodos de detecção que alcancem concentrações menores que 1 ng mL-1 , como no caso da espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) e espectroscopia Raman aprimorada por superfície (SERS), esses analitos são detectados. Com essas plataformas, há a redução do preparo de amostras, bem como resultam em respostas mais fáceis e rápidas. Há também outra janela de oportunidade ao empregar esses métodos que é o uso de análise multivariada de dados para melhorar o desempenho do diagnóstico. Levando em consideração essa perspectiva, o objetivo desta tese é desenvolver plataformas ultrassensíveis suportadas por ferramentas quimiométricas para fornecer ensaios confiáveis para classificar soros humanos em infectados ou não infectados, por HVL. Desta forma, o peptídeo antigênico PSAdP23-47 foi empregado como elemento de reconhecimento em duas plataformas bioanalíticas. A primeira plataforma foi montada pela imobilização do PSAdP23-47 em um eletrodo de ouro com nanofibras eletrofiadas de poliamida-6 (PA6)/quitosana para demonstrar o potencial peptídico para detectar anticorpos específicos para leishmania em amostras clínicas. Esta plataforma utilizou o EIS como técnica de transdução e obteve um desempenho excepcional. Após a otimização, as mudanças relativas na impedância foram proporcionais ao valor logarítmico da concentração de anticorpos anti-PSAdP23-47 na faixa de 2,5 a 10 pg mL-1 (r2= 0,9946) com limite de detecção de 0,2 pg mL-1 . A plataforma também provou ser seletiva para este anticorpo específico e forneceu uma resposta confiável para amostras clínicas infectadas e nenhuma resposta para amostras não infectadas. A segunda plataforma foi projetada usando um imunoensaio homogêneo SERS usando nanopartículas de ouro¿PSAdP23-47 para transduzir a resposta contra anticorpos anti-PSAdP23-47. A caracterização por espalhamento de luz revelou que a adição do peptídeo à AuNP aumenta poucos nanômetros da camada de solvatação, e com a adição do anticorpo anti-PSAdP23-47, um aumento relevante da camada de solvatação ocorre. Outros estudos de UV-VIS e SEM também revelaram que a última etapa promoveu a agregação de AuNP/PSAdP23-47, fornecendo espectros SERS complexos com uma notável intensificação de sinal. Empregando resolução de curva multivariada com mínimos quadrados alternados (MCR-ALS), pode-se encontrar uma região característica que diferencia amostras infectadas de não infectadas. Com o modelo de mínimos quadrados parciais com análise discriminante (PLS-DA), foi possível atingir 100% de sensibilidade e 88,2% de especificidade para amostras externas. Em resumo, duas plataformas ultrassensíveis foram desenvolvidas para avançar no combate ao HVL. Enquanto a primeira plataforma provou ser uma plataforma robusta para detectar anticorpos específicos em amostras clínicas em concentrações muito baixas, a segunda provou ser uma metodologia versátil e confiável. Embora um espectro complexo tenha sido adquirido, ferramentas quimiométricas foram capazes de identificar regiões de assinatura e usálas para classificar corretamente amostras clínicas. Essas conquistas trazem contribuições importantes não apenas para o diagnóstico da HVL, mas também para a pesquisa em bioanalítica, permitindo o avanço do conceito de plataforma modular e da abordagem multivariada para resolver problemas complexos. Human visceral leishmaniasis (HVL) is a significant neglected tropical disease that caused 90,000 deaths, with nearly 12 million people are affected worldwide in 2020. Because therapies for this disease are very aggressive, an early diagnosis is essential. The existing methods are either expensive and laborious or need costly instruments or complicated fabrication methods. For this reason, recent biosensors trends involve the development of new platforms using the antibodies produced by the humoral response employing detection methods that can achieve concentrations lower than 1 ng mL-1 , like electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and Surface-enhanced Raman Spectroscopy (SERS). With these platforms, reduced sample preparation and more accessible and quicker responses are provided. There is also another window of opportunity when employing these methods: multivariate data analysis to enhance the diagnosis performance. Considering this outlook, this thesis objective is to develop ultrasensitive platforms supported by chemometric tools to provide a reliable assay to classify human sera infected or not-infected by HVL. To accomplish it, an antigenic peptide PSAdP23-47 was employed as a recognition element into two bioanalytical platforms. The first platform was assembled by immobilizing PSAdP23-47 on a gold electrode with an electrospun polyamide-6 (PA6)/chitosan nanofibers to demonstrate the peptide potential to detect leishmanial specific antibodies in clinical samples. This platform used EIS as transduction technical and performed outstandingly; After the optimization, relative changes in impedance were proportional to the logarithmic value of anti-PSAdP23-47 antibodies in the range of 2.5 to 10 pg?mL-1 (r 2= 0.9946) with a detection limit of 0.2 pg?mL-1 . The platform also proved to be selective to this specific antibody and provided a reliable response for infected clinical samples and no response for not-infected samples. The second platform was designed using a SERS homogeneous immunoassay using gold nanoparticles¿ PSAdP23-47 assemblies to transduce the response against anti-PSAdP23-47 antibodies. Light scattering characterization revealed that the peptide addition to the AuNP increases a few nanometers of the solvation layer, and with anti-PSAdP23-47 antibody addition, a relevant increase of the solvation layer. Further UV-VIS and SEM studies also revealed that the last step promoted aggregation of AuNP/PSAdP23-47, providing a complex SERS spectrum, enabling remarkable enhancements. Employing multivariate curve resolution alternating least squares (MCR-ALS), we were able to find a fingerprint region that differentiates infected from non-infected samples. With the partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) model, it was possible to achieve 100% sensitivity and 88.2% specificity for external samples. In summary, two platforms ultrasensitive platforms were developed to advance the fight against the HVL. While the first platform proved to be a robust platform to detect specific antibodies in clinical samples in very low concentrations, the second one proved to be a versatile and reliable methodology. Although complex spectrum was acquired, chemometric tools identified signature regions and used them to classify clinical samples correctly. These achievements bring essential contributions not only for HVL diagnosis but also for bioanalytical research, allowing the modular concept and the multivariate approach to solve complex problems.
Databáze: OpenAIRE
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