Application of a synthetic gene expression control system for the production of vitamin B2 in Bacillus subtilis

Autor: Amorim, Laura Araujo da Silva
Přispěvatelé: Universidade Estadual Paulista (Unesp), Pedrolli, Danielle Biscaro
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2021
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da UNESP
Universidade Estadual Paulista (UNESP)
instacron:UNESP
Popis: Submitted by Laura Araujo Da Silva Amorim (laura.amorim@unesp.br) on 2021-09-30T02:58:06Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Laura Araujo da Silva Amorim.pdf: 3869199 bytes, checksum: 9d41d7eb5cc9dba1fd55508473693a8d (MD5) Approved for entry into archive by Maria Irani Coito (irani@fcfar.unesp.br) on 2021-09-30T12:48:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 amorim_las_me_arafcf_int.pdf: 3852490 bytes, checksum: b192e2c488995330f7f99a4b616eed64 (MD5) Made available in DSpace on 2021-09-30T12:48:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 amorim_las_me_arafcf_int.pdf: 3852490 bytes, checksum: b192e2c488995330f7f99a4b616eed64 (MD5) Previous issue date: 2021-08-31 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) A riboflavina é uma vitamina solúvel em água que possui papel essencial no crescimento e desenvolvimento celular, sua produção anual total é de aproximadamente 9000 toneladas, sendo um bioprocesso rentável. As cepas industriais utilizadas para a produção de riboflavina foram obtidas através de técnicas de mutagênese, porém as mesmas apresentam limitações referentes ao crescimento celular e a produtividade da biomolécula. Com o avanço no conhecimento sobre a diversidade, estrutura e função dos RNAs não codificantes houve a possibilidade da sua utilização na regulação de diversos metabolismos microbianos. Sendo o metabolismo de purinas e riboflavina em Bacillus subtilis controlado por mecanismo de regulação do término prematuro da transcrição, os riboswitches, o uso de RNAs como mecanismo regulador se torna uma possível ferramenta para criação de cepas industriais superprodutoras destes compostos. Sendo assim, ambicionou-se a criação de cinco sRNAs sintéticos para avaliação da interferência dos mesmos na regulação negativa causada pelos riboswitches do metabolismo de purinas e riboflavina em B. subtilis. Foram desenvolvidas, então, linhagens de B. subtilis contendo um sRNA, sendo específico para cada riboswitch presente no metabolismo de purinas e na produção de riboflavina, além de um sRNA capaz de parear com o RBS do mRNA contendo o gene purR. Além desses sRNAs serem introduzidos no cromossomo de B. subtilis individualmente, foram introduzidos os dois sRNAs com os resultados mais promissores (ribDG e purR) e também um operon contendo todos os sRNAs, estando esses conjugados a diferentes ribozimas, em um transcrito único. Dessa forma, observou-se que as linhagens desenvolvidas apresentaram o crescimento esperado indicando que a inserção não promoveu estresse metabólico para a célula, em alguns casos até melhoraram a densidade populacional em relação à linhagem parental. Porém, ao analisar a produção de riboflavina quantificada via HPLC, conclui-se que as cepas contendo os sRNAs xpt, purR e ribDG apresentaram aumento da produção em 48%, 34% e 30%, respectivamente. Essas três linhagens foram cultivadas aumentando a escala para frasco de Erlenmeyer, onde observou-se que os sRNAs ribDG e purR, tiveram cerca de 50% maior produção de riboflavina que o controle. Dessa forma construiu-se um operon composto pelos sRNAs purR e ribDG e a linhagem contendo este operon no genoma aumentou 10% a produção de riboflavina em comparação com B. subtilis com um sRNA apenas, representando aumento de 65% em comparação com a linhagem parental. Em relação ao sistema com todos os sRNAs desenvolvidos em um transcrito único, este foi introduzido no cromossomo de três linhagens diferentes de B. subtilis. Essas linhagens também não apresentaram problemas no crescimento, sendo que a produção de riboflavina em escala de Erlenmeyer alcançou níveis superiores em comparação ao seu controle em 44% para a cepa de B. subtilis superprodutor de riboflavina e 65% para a cepa de B. subtilis RFAi. Sendo assim, ao utilizar sRNAs sintéticos para desenvolver cepas produtoras de riboflavina aprimoradas, provamos que os sRNAs são adequados para a regulação da expressão em B. subtilis. A facilidade de projetar e construir, e o fato de que o sRNA direcionado ao riboswitch funciona com uma única cópia do genoma, o tornam uma ferramenta atraente para a engenharia de cepas produtoras de metabólitos industriais. Além disso comprovamos a interferência na regulação gênica de riboswitches no metabolismo de purinas e riboflavina em B. subtilis resultando em linhagens aprimorada para produção desses compostos de interesse industrial. Riboflavin is a water-soluble vitamin that plays an essential role in cell growth and development, its total annual production is approximately 9000 tons, making it a profitable bioprocess. The industrial strains used for the production of riboflavin were obtained through mutagenesis techniques, but they have limitations regarding cell growth and biomolecule productivity. With the advance in knowledge about the diversity, structure, and function of non-coding RNAs, there was the possibility of their use in the regulation of several microbial metabolisms. Since the metabolism of purines and riboflavin in Bacillus subtilis is controlled by a mechanism that regulates the premature termination of transcription, the riboswitches, the use of RNAs as a regulatory mechanism becomes a possible tool for the creation of industrial strains that overproduce these compounds. Therefore, the creation of five synthetic sRNAs was aimed at evaluating their interference in the down-regulation caused by riboswitches of purine and riboflavin metabolism in B. subtilis. Then, strains of B. subtilis containing an sRNA were developed, specific for each riboswitch present in the metabolism of purines and the production of riboflavin, in addition to an sRNA capable of pairing with the RBS of the mRNA containing the purR gene. In addition to these sRNAs being introduced into the chromosome of B. subtilis individually, the two sRNAs with the most promising results were introduced (ribDG and purR) and also an operon containing all sRNAs, these being conjugated to different ribozymes, in a single transcript. Thus, it was observed that the strains developed presented the expected growth, indicating that the insertion did not promote metabolic stress for the cell, in some cases, they even improved the population density with the parental strain. However, when analyzing the production of riboflavin quantified via HPLC, it is concluded that the strains containing the sRNAs xpt, purR, and ribDG showed an increase in production of 48%, 34%, and 30%, respectively. These three strains were grown upscale to Erlenmeyer flask, where it was observed that the sRNAs ribDG and purR had about 50% greater production of riboflavin than the control. Thus, an operon composed of purR and ribDG sRNAs was constructed and the strain containing this operon in the genome increased riboflavin production by 10% compared to B. subtilis with only one sRNA, representing an increase of 65% compared to the parental strain. Regarding the system with all sRNAs developed in a single transcript, this was introduced into the chromosome of three different strains of B. subtilis. These strains did not show growth problems either, with Erlenmeyer scale riboflavin production reaching higher levels compared to its control in 44% for the riboflavin super-producing B. subtilis strain and 65% for the B. subtilis strain RFAi. Therefore, by using synthetic sRNAs to develop improved riboflavin-producing strains, we proved that sRNAs are suitable for the regulation of expression in B. subtilis. The ease of design and construction, and the fact that riboswitch-targeted sRNA works with a single copy of the genome, make it an attractive tool for engineering strains producing industrial metabolites. Furthermore, we proved the interference in the gene regulation of riboswitches in the metabolism of purines and riboflavin in B. subtilis, resulting in improved strains for the production of these compounds of industrial interest. CAPES: 88887.334870/2019-00
Databáze: OpenAIRE
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