Genetic variability and sensitive of Cercospora kikuchii, Colletotrichum truncatum and Corynespora cassiicola to fungicides

Autor: Flávia Elis de Mello
Přispěvatelé: Maria Isabel Balbi-Peña [orientador]., Claudia Vieira Godoy [Coorientador]., Francismar Corrêa Marcelino-Guimarães, Valéria Stefania Lopes-Caitar, Ciro Hideki Sumida, Louise Larissa May De Mio
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2019
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UEL
Universidade Estadual de Londrina (UEL)
instacron:UEL
Popis: Os fungicidas metil benzimidazol carbamato (MBC), inibidores da quinona externa (IQe), inibidores da desmetilação (IDM) e inibidores da succinato desidrogenase (ISDH) são utilizados para o controle de doenças causadas por Cercospora kikuchii, Colletotrichum truncatum e Corynespora cassiicola na cultura da soja no Brasil. No entanto, devido a aplicações excessivas, indivíduos variantes presentes nas populações destes fungos podem ser selecionados, resultando em menor sensibilidade a fungicidas anteriomente eficazes. Os principais objetivos deste trabalho foram: i) determinar os níveis de sensibilidade ou resistência aos fungicidas das diferentes espécies de fungo; ii) avaliar in vitro a resistência cruzada das populações de C. kikuchii e C. cassiicola aos fungicidas do grupo MBC (carbendazim e tiofanato-metílico) e IQe (azoxistrobina, picoxistrobina e piraclostrobina); iii) determinar a concentração efetiva para inibir 50% (CE50) da população de C. cassiicola aos fungicidas carbendazim (MBC), piraclostrobina (IQe) e protioconazol (IDM); iv) caracterizar os possíveis polimorfismos nos genes-alvo cyp51, ?-tubulina, citocromo b (cyt b), e Sdh (subunidades b, c, d) e sua relação com a resistência; v) analisar as variações heterozigóticas das mutações e vi) estudar a diversidade genética entre isolados sensíveis e resistentes a partir das variações obtidas nos diferentes genes analisados. Os fungos foram isolados de folhas de soja coletados em diferentes safras e regiões de cultivo. A resistência cruzada foi testada pelo método de crescimento micelial em meio de cultura utilizando a dose discriminatória de 10 ?g/mL dos fungicidas carbendazim, tiofanato-metílico, azoxistrobina, picoxistrobina e piraclostrobina para o fungo C. cassiicola. A CE50 foi analisada por meio do método de microtitulação colorimétrica com absorbância de 540 nm. Os polimorfismos nos genes-alvos dos fungicidas foram analisados com base no sequenciamento de nova geração, com uma profundidade de 30.000 reads, no equipamento Illumina MiSeq. A CE50 de C. cassiicola variou entre 0 e 100 µg/mL para os três fungicidas testados. Houve resistência cruzada positiva entre os ingredientes ativos que pertencem aos grupos químicos MBC e IQe para C. kikuchii e C. cassiicola. Na caracterização molecular de C. kikuchii para o gene ?-tubulina foram encontradas apenas mutações sinônimas para todos os isolados analisados. Para C. truncatum foi encontrada a mutação A244E. Já, para C. cassiicola foram identificadas as mutações S168Y, I189V, E198A, F200Y e S275N. No caso do gene cyt b, a análise dos polimorfismos para os três fungos analisados, identificou a substituição de glicina para alanina na posição 143 (G143A). As mutações F129L e G137R não foram encontradas para nenhuma das três espécies avaliadas. A análise molecular do gene cyp51 identificou as mutações Q161H, N178D, P180S, P200L, K217R, E274D, S279N, E281K, T290S, I299V, S363N, K442Q e L503V para isolados de C. kikuchii, 44 mutações não sinônimas para C. truncatum e as mutações S279N e I299V para C. cassiicola. Para os genes Sdh (subunidades a, b, c, d) foram encontrados 23 pontos de mutação para o gene SdhA e 25 mutações para o gene SdhB em C. truncatum. Para C. kikuchii foram observadas mutações sinônimas para SdhA e 14 substituições para o gene SdhB: H17L, G27A, T167M, P192L, E200D, N290K, I320N, I434V, A436V, D447N, H448R, E454Q, N513S e Q569K. Para C. cassiicola foram identificadas mutações nas posições 318, 454, 461, 556, (A-E318D, I454V, A461S, Y556F), 34, 39, 260 (B-A34V, V39I, K260R), 37, 61, 85, 163, (C-Q37H, S61T, G85S, I163V) e 126 (D-V126I), respectivamente. Apesar, do elevado polimorfismo observados nos genes que conferem resistência a fungicidas, para os três fungos analisados não houve correlação entre os isolados fenotipicamente classificados com resistentes e os isolados mutantes. Portanto, novos estudos devem ser realizados para confirmar se as novas mutações observadas nesse estudo estão correlacionadas com a resistência a fungicidas. Os isolados considerados menos sensíveis aos fungicidas, foram os isolados que apresentam as mutações G143A, E198A e F200Y, que já estavam descritas na literatura. Mutações múltiplas aos fungicidas MBC e QoI foram relatadas em C. cassiicola, sendo a mutações G143A + E198A a mais frequente. Variantes homozigóticas e heterozigóticas foram encontradas em todas as espécies e em todos os genes analisados. A alta diversidade genética encontradas neste estudo são responsáveis pela alta variabilidade genética dos isolados de C. kikuchii e C. cassiicola. Além disso, mais estudos devem ser realizados para confirmar se os novos polimorfismos encontrados nessa pesquisa, conferem resistência a fungicidas. Methyl benzimidazole carbamate (MBC), quinone oxidase inhibitors (QoI), demethylation inhibitors (DMI) and succinate dehydrogenase inhibitors (SDHI) are fungicides groups used to control Cercospora kikuchii, Colletotrichum truncatum and Corynespora cassiicola in soybean fields in Brazil. However, due to excessive applications, variant individuals present in the natural populations of these fungi were selected, resulting in a lower sensitivity to the fungicides previously effective. Therefore, the main goals were: i) to determine the sensitivity or resistance levels to the fungicides of the different fungus species; ii) to evaluated cross-resistance in vitro of C. kikuchii and C. cassiicola to the fungicides MBC (carbendazim and thiophanate methyl) and QoI (azoxystrobin, picoxystrobin and pyraclostrobin); iii) to define the effective concentration to inhibition 50% (EC50) of spore germination of C. cassiicola to the fungicides carbendazim (MBC), pyraclostrobin (QoI) and prothioconazole (DMI); iv) to characterize the possible polymorphisms in the target genes cyp51, ?-tubulin, cytochrome b (cyt b), and Sdh (subunits b, c, d) and their correlation with resistance; v) to analyze heterozygous variations of mutations and vi) to study genetic diversity in sensitive and resistant isolates from the variations obtained in the different genes analyzed. Fungi were isolated from soybean leaflets collected in fields in different growing seasons. The EC50 sensitivity of isolates C. cassiicola was analyzed by colorimetric microtiter method, using absorbance with wavelengths at 540 nm. Cross-resistance was tested for MBC and QoI fungicides by radial growth assay in amended medium using discriminatory dose (10 ?g/mL) of carbendazim, thiophanate-methyl, azoxystrobin, picoxystrobin and pyraclostrobin fungicides. The isolates were sequenced using next generation sequencing approach with 30,000 reads using Illumina MiSeq equipment. The EC50 of C. cassiicola ranged from 0 to 100 ?g / mL for the three fungicides tested. There was a high positive cross-resistance between the active ingredients of the MBC and QoI chemical groups for C. kikuchii and C. cassiicola. Molecular characterization of C. kikuchii for the ?-tubulin gene was found only for the identification of all isolates. For C. truncatum, the A244E mutation was found. For C. cassiicola were found the S168Y, I189V, E198A, F200Y and S275N mutations. Sequencing of the cyt b gene for the three species analyzed identified the glycine mutations for alanine at position 143 (G143A). The F129L and G137R mutations were not found for any species. Molecular analysis of the cyp51 gene revealed mutations Q161H, N178D, P180S, P200L, E274D, S279N, E281K, T290S, I299V, S363N, K442Q and L503V for C. kikuchii, 44 nonsynonymous mutations for C. truncatum and S279N and I299V mutations for C. cassiicola. For the Sdh genes (subunits a, b, c, d), 23 point mutation were found for SdhA gene and 25 mutations for the SdhB gene in C. truncatum. The mutations observed for SdhB in C. kikuchii were: H17L, G27A, T167M, P192L, E200D, N290K, I320N, I434V, A436V, D447N, H448R, E454Q, N513S and Q569K. For C. cassiicola were found substitutions at codon 318, 454, 461, 556, (A-E318D, I454V, A461S, Y556F), 34, 39, 260 (B-A34V, V39I, K260R), 37, 61, 85, 163, (C-Q37H, S61T, G85S, I163V) and 126 (D-V126I), respectively. Despite, the high polymorphism observed in the genes that confer fungicide resistance, for three fungi analyzed, no correlation had been observed between isolates phenotypically classified as resistant and the isolates which showed mutations. Therefore, further studies should be performed to confirm if the new mutations found in this study are correlate with fungicide resistance. Isolates with less sensitive to fungicides, were the isolates that showed the mutations G143A, E198A and F200Y, which were already been described in the literature. Multiple mutations to MBC and QoI fungicides have been reported in C. cassiicola, being the G143A + E198A the most frequent. Homozygous and heterozygous variants were found for the three species. High genetic diversity found in this study, are responsible for the high genetic variability of the isolates of C. kikuchii and C. cassiicola. In addition, further studies should be conducted to confirm whether the new polymorphisms found in this research confer resistance to fungicides.
Databáze: OpenAIRE
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