Genotipagem de amostras de Trypanosoma cruzi isoladas de pacientes chagásicos de dois municípios da região do Vale do Jequitinhonha, MG, Brasil

Autor: Oliveira, Maykon Tavares de
Přispěvatelé: Lana, Marta de
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2012
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da UFOP
Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP)
instacron:UFOP
Popis: A espécie do Trypanosoma cruzi possui uma estrutura genética que permite a subdivisão intraespecífica em seis grupos genéticos distintos, denominados TcI, TcII, TcIII, TcIV, TcV e TcVI (Zingales et al., 2009) que tem apresentado diferenças frente a distribuição geográfica, propriedades biológicas e susceptibilidade a droga. É conhecido o predomínio das DTU’s TcII e TcVI em diversas regiões Brasileiras, associados tanto ao ciclo doméstico como ao silvestre da Doença e Chagas, e estando intimamente relacionados com as manifestações clínicas graves em pacientes chagásicos crônicos. Conhecendo o predomínio dessas DTU’s no estado de Minas Gerais, trabalhos anteriores do grupo realizando a genotipagem de um número limitado de amostras destas mesmas localidades (municípios de Berilo e José Gonçalves de Minas, Vale do Jequitinhonha, MG) mostrou a presença somente de amostras de T. cruzi II, como ocorre em outras regiões do Brasil. Desse modo, o objetivo principal do estudo foi caracterizar molecularmente amostras de T. cruzi isoladas de pacientes chagásicos crônicos dos municípios de Berilo e José Gonçalves de Minas, Vale do Jequitinhonha, MG, a fim de determinar o perfil genético do parasito circulante nesta região e comparar esses dados com o observado no Brasil e em outras regiões do Cone Sul. Para isto, os parasitos foram isolados dos pacientes através de hemocultura e mantidos em crescimento em meio LIT para obtenção das massas úmidas e posterior extração de DNA e caracterização por cinco diferentes marcadores moleculares. A identificação inicial dos grupos genéticos do T. cruzi foi realizada seguindo o tríplice ensaio proposto por Lewis et al.(2009). Essa metodologia explora a análise em conjunto dos perfis de bandas gerados após a amplificação do domínio D7 do 24Sα rDNA, do perfil de corte gerado após a digestão dos produtos amplificados de dois genes com suas respectivas enzimas de restrição (HSP60/ECORV e GPI/HhaI) via RFLP-PCR. Nesta primeira etapa de caracterização foram identificadas 43 amostras, sendo todas pertencentes ao grupo TcII, segundo a nova classificação consensual proposta por Zingales et al. (2009). Entretanto, oito isolados não puderam ter sua identificação definida baseada nessa metodologia e foram submetidas à análise do polimorfismo do gene da citocromo oxidase subunidade II (CoII), 24Sα rDNA e do espaçador intergênico do mini-exon (SL-IR), que permitiram em conjunto, classificá-las como TcVI. A seguir, a técnica de RAPD foi empregada na avaliação da variabilidade intra-específica dos isolados do T. cruzi empregando 10 iniciadores. Os dados obtidos pela análise dos dez iniciadores, foram submetidos à análise de UPGMA para obtenção do fenograma e os resultados obtidos corroboram os dos outros marcadores na identificação da maioria dos isolados (43) como TcII e dos oito restantes como TcVI, revelando ainda pouca variabilidade no interior desses grupos. Os resultados desse trabalho confirmam dados preliminares obtidos na região em estudo, demonstrando a predominância dos isolados de T. cruzi pertencentes ao grupo TcII no município de Berilo, semelhante ao demonstrado por outros estudos que avaliaram isolados obtidos de pacientes em outras regiões no eixo nordeste-sul do Brasil. Adicionalmente, foram detectados ainda alguns isolados de TcVI cuja ocorrência é mais rara no Brasil, diferentemente de outros países da América do Sul. Currently Trypanosoma cruzi is classified into six discrete taxonomic units (DTUs) TcI, TcII, TcIII, TcIV, TcV and TcVI that present significant differences concerned the geographic distribution and biological properties. This study was conducted to verify the genetic profile of this parasite isolated of patients from Berilo and José Gonçalves de Minas municipalities, Jequitinhonha Valley, MG, an important endemic area of Chagas disease in Brazil. Molecular characterization was performed through of five different markers in fifty T. cruzi stocks isolated by hemoculture from patients in chronic phase of Chagas disease. DNA extraction was performed using the DNA Purification KIT (Promega, USA). The first identification of the six T. cruzi genetic groups followed the methodology of Lewis et al. (2009). This methodology explores the set of profiles of bands originated after the amplified products of dominium D7 of 24Sα rDNA, profile of bands originated after the digestion of products amplified of two genes with their respective restriction enzymes (HSP60/ECORV e GPI/HhaI) via RFLP-PCR. In this first phase of characterization 43 samples were typed as T. cruzi of TcII group according to the new consensual classification of Zingales et al. (2009). However, eight isolates did not have the genetic identity defined based on this methodology, being submitted to polymorphic analysis of the subunit II (CoII) of citochrome oxidase and of the spliced leader intergenic region of mini-exon (SL-IR) which when associated classified these isolates as TcVI. After, the RAPD technique was employed in the evaluation of intra-especific variability of the T. cruzi isolates using ten primers. Data obtained were submitted to the UPGMA analysis and the results corroborate the originated from the other markers identifying the majority of the isolates as TcII and the other eight isolates as TcVI, showing yet some intra-groups variability with two groups defined into them. The results of this work confirm the preliminary data obtained of the studied region, showing a predominance of T. cruzi isolates of TcII in Berilo, similar to the verified in other studies that evaluated isolates of patients in other regions of Brazil. Additionally, although less frequently, some isolates of TcVI were also detected. These data confirmed the distinct profile observed in Brazil compared to other countries of South America.
Databáze: OpenAIRE
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