Cryopreservation of in vitro grown shoot tips and roots and phytochemical evaluation of Cleome rosea Vahl ex DC. (Cleomaceae)

Autor: Cordeiro, Lívia da Silva
Přispěvatelé: Albarello, Norma, Gurgel, Claudia Simões, Oliveira, Elisabeth Atalla Mansur de, Almeida, Georgia Pacheco Peters de, Sato, Alice, Victório, Cristiane Pimentel
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2016
Předmět:
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UERJ
Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ)
instacron:UERJ
Popis: Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-05T18:21:02Z No. of bitstreams: 1 Tese Completa Livia da Silva Cordeiro_PPGBV.pdf: 9380229 bytes, checksum: ce132b975101cc34292ef57f8776fc2b (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-05T18:21:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Completa Livia da Silva Cordeiro_PPGBV.pdf: 9380229 bytes, checksum: ce132b975101cc34292ef57f8776fc2b (MD5) Previous issue date: 2016-05-24 Universidade do Estado do Rio de Janeiro Species of the genus Cleome L. have been reported by their different medicinal properties. Recent studies revealed the medicinal potential of Cleome rosea, a native species occurring in Brazilian restingas, ecosystems changed through human actions. The first plant tissue culture studies were performed at the Laboratory of Plant Biotechnology (Labplan) of UERJ, resulting in the establishment of different in vitro systems and the production of anthocyanins and carotenoids, secondary metabolites with medicinal interest. Adventitious root cultures, with high biomass accumulation, have also been established, showing the significant potential for commercial exploration of these in vitro systems. Thus, it is important to develop conservation strategies, as well as to investigate the phytochemical diversity of this species. This study aimed to evaluate cryopreservation methods for in vitro conservation of shoot tips and roots. Additionally, phytochemical analysis was performed using field-grown plants and in vitro cultures (callus and roots cultures). Cryopreservation methods based on the use of vitrification solutions to prepare the material for the preservation in liquid nitrogen were evaluated. For cryopreservation of shoot tips, efficient vitrification protocols have been established using aluminum plates (cryo-plates) with vitrification solutions PVS2 and PVS3. It was achieved a recovery rate of 100% for the cryopreserved shoot tips treated with the phytoregulator Benzylaminopurine (BA) and maintained under diffuse light during the recovery step. For cryopreservation of roots, it were evaluated the vitrification and encapsulation-vitrification techniques using the PVS3 solution. Recovery rate above 90% was achieved when cryopreserved roots were encapsulated in calcium alginate matrix, washed gradually in the unloading solution and were inoculated on solid MS medium during the recovery step. The cryopreserved roots showed multiplication capacity after recovery, which was maintained for up to four subcultures. The effect of the cryopreservation steps on the roots structural integrity was evaluated by histological and histochemical studies. Tissues alterations were more significant in the cortex of the roots, characterized by the accumulation of polysaccharides, proteins and lipidic and pectic substances in the intercellular spaces during the cryopreservation process. The vascular cylinder remained intact, ensuring the formation of new roots from the pericycle, showing the maintenance of the proliferative capacity of the cryopreserved roots. The phytochemical studies demonstrated the presence of secondary metabolites in the different extracts from field-grown plants, as well as from roots and callus cultures. The chromatographic analysis allowed to suggest the presence of different classes of secondary metabolites as phenolic compounds, alkaloids, terpenoids, steroids, saponins and fatty acids. These results demonstrate the long-term storage possibilities for in vitro cultures of C. rosea by cryopreservation and the phytochemical diversity of this species in nature and under in vitro systems Espécies do gênero Cleome L. têm sido reportadas por suas relevantes aplicações terapêuticas. Estudos recentes têm revelado o potencial medicinal de Cleome rosea, espécie nativa ocorrente em restingas brasileiras, ecossistemas alterados por ações antrópicas. Os primeiros trabalhos de cultura de tecidos da espécie foram realizados no Laboratório de Biotecnologia de Plantas (Labplan) da UERJ, com o estabelecimento de diferentes sistemas in vitro e a produção de metabólitos especiais de interesse medicinal, das classes das antocianinas e carotenoides. Culturas de raízes adventícias também foram estabelecidas, com grande produção de biomassa, demonstrando o alto potencial de exploração desses sistemas. Dessa forma, torna-se relevante o desenvolvimento de estratégias de conservação, bem como de investigações a cerca da diversidade fitoquímica dessa espécie. O presente trabalho objetivou o estudo de metodologias de criopreservação para ápices caulinares e raízes, culturas in vitro que permitem a propagação massal de C. rosea. Adicionalmente, foi realizada análise fitoquímica de materiais obtidos sob condições naturais e cultivados in vitro por meio de dois sistemas recomendados para a produção de metabólitos especiais: culturas de calos e de raízes. Foram testados métodos de criopreservação que se baseiam no uso de soluções de vitrificação que preparam o material a ser conservado em nitrogênio líquido. Para a criopreservação dos ápices caulinares foram estabelecidos protocolos eficientes de vitrificação em placas de alumínio (V-crioplaca) baseados no uso das soluções de vitrificação PVS2 e PVS3. Foi possível alcançar 100% de recuperação dos ápices criopreservados empregando-se o fitorregulador Benzilaminopurina (BA) e mantendo o material sob luz difusa na etapa de recuperação. Para as raízes, foram avaliados protocolos de vitrificação e de encapsulamento-vitrificação com a solução de vitrificação PVS3. Foi alcançada frequência de recuperação pós-criopreservação superior a 90% quando as raízes encapsuladas em matriz de alginato de cálcio passaram por lavagem gradativa com solução unloading e foram inoculadas em meio sólido na etapa de recuperação. As raízes apresentaram capacidade de multiplicação após a recuperação, a qual se manteve por até quatro subculturas. Avaliou-se, por meio de estudos histológicos e histoquímicos, o efeito das etapas do protocolo de criopreservação sobre a integridade estrutural das raízes. As mudanças observadas nos tecidos foram mais significativas no córtex das raízes, sendo observado o acúmulo de polissacarídeos e proteínas e de substâncias de natureza lipídica e péctica nos espaços intercelulares ao longo do processo de criopreservação. Já o cilindro vascular manteve-se íntegro, o que garantiu a formação de novas raízes a partir do periciclo, evidenciando a manutenção da capacidade proliferativa das raízes criopreservadas. Os estudos fitoquímicos permitiram avaliar a presença de metabólitos especiais em diferentes partes da planta obtida em condições naturais, bem como em culturas in vitro de raízes e calos. As análises por técnicas de cromatografia permitiram sugerir a presença de substâncias pertencentes a diferentes classes de compostos fenólicos, bem como às classes dos alcaloides, terpenoides, esteroides,saponinas e ácidos graxos. Esses resultados demonstram as possibilidades de conservação em longo prazo de culturas in vitro de C. rosea por meio de criopreservação e a diversidade fitoquímica da espécie na natureza e em sistemas in vitro
Databáze: OpenAIRE
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