Seleção in silico e expressão diferencial de genes de defesa em uva (Vitis vinífera l.) sob condições de estresse biótico

Autor: SILVA, Jéssica Barboza da
Přispěvatelé: BENKO-ISEPPON, Ana Maria, SILVA, Roberta Lane de Oliveira, MELO, Natoniel Franklin de
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2018
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da UFPE
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)
instacron:UFPE
Popis: CAPES O gênero Vitis destaca-se entre as espécies frutíferas mais cultivadas mundialmente, apresentando grande importância econômica. Apesar dos altos rendimentos alcançados em sua produtividade, as espécies de Vitis tem apresentado susceptibilidade a vários agentes patogênicos, em especial a bactéria Xanthomonas citri pv. anacardii (Xcpa) considerada um dos mais sérios fatores limitantes para a produção de uvas de mesa e vinho em Pernambuco. O presente trabalho objetivou identificar, caracterizar e validar genes de resistência (R) promissores e relacionados aos processos de defesa vegetal em acessos contrastantes quanto à resistência a Xcpa para aplicação em programas de melhoramento genético da cultura. Dessa forma, foi conduzido um experimento em casa de vegetação visando à geração de bibliotecas de RNA-Seq de videira usando clones da cultivar ‘Red Globe’, considerada susceptível ao cancro bacteriano e do híbrido IAC-572 considerado moderadamente resistente ao cancro bacteriano. As plantas foram inoculadas com Xcpa e o RNA total foi extraído e enviado para construção das bibliotecas de RNA-Seq. Os genes de interesse foram minerados e caracterizados com o auxílio de ferramentas de bioinformática. Genes normalizadores e alvos de interesse foram validados via RT-qPCR. A partir das análises in silico, foi possível identificar 894 genes de resistência, contemplando todas as classes, sendo os RLP, STK e NBS mais representativos no transcriptoma de Vitis. A análise fenética utilizando candidatos da classe NBS-LRR formou sete clusters, os candidatos que possuíam os domínios NBS, NBS-LRR, CC-NBS e CC-NBS-LRR agruparam em seis clusters. A seleção dos genes de referência com base na análise de estabilidade em softwares específicos indicou um conjunto funcional de normalizadores para as duas cultivares de Vitis, sendo os três melhores (TRU5, TCBP e 60SRP) utilizados para a validação via RT-qPCR dos genes de interesse (NBS-LRR12, RLK, STK e STK4), selecionados nas bibliotecas de RNA-Seq. Desses, RLK e STK não tiveram sua expressão alterada nos tempos avaliados em nenhuma das cultivares. NBS-LRR12 e STK4 não apresentaram expressão diferencial nos dois primeiros tempos (90 minutos e 24 horas após a inoculação), porém, foram superexpressos com 48 horas de estresse na cultivar resistente e não significativos na cultivar susceptível, indicando uma resposta genótipo tardia e específica. Os resultados contribuíram para um melhor entendimento das características moleculares dos genes de resistência e sua participação no processo de defesa em videira. The genus Vitis stands out among the fruit species most cultivated worldwide, presenting great economic importance worldwide. Despite the high product yields, Vitis spp. have been susceptible to several pathogens, especially the bacterium Xanthomonas citri pv. anacardii, considered one of the most serious limiting factors to produce table grapes and wine in Pernambuco. The present work aimed to identify, characterize and validate promising resistance genes related to the processes of plant defense in contrasting accessions to resistance to X. citri for application in crop breeding programs. Thus, a greenhouse experiment was conducted aiming at the generation of grapevine RNA-Seq libraries using clones of the 'Red Globe' cultivar, considered susceptible to bacterial cancer and of the hybrid IAC-572, considered moderately resistant to bacterial cancer. The plants were inoculated with Xcv and total RNA was extracted and sent for construction of the RNA-Seq libraries. Genes of interest were mined and characterized through different bioinformatics tools. Reference genes and targets were validated via RT-qPCR. From the in silico analyzes, it was possible to identify 894 resistance genes, contemplating all classes, being the RLP, STK and NBS more representative in the Vitis transcriptome. NBS-LRR, CC-NBS and CC-NBS-LRR domains were grouped into six clusters. The selection of the reference genes based on stability analysis in specific software indicated a functional set of normalizers for the two Vitis cultivars, the three best ones (TRU5, TCBP and 60SRP) being used for RT-qPCR validation of the target genes (NBS-LRR12, RLK, STK and STK4), selected from the RNA-Seq libraries. Of these, RLK and STK did not have their expression altered at times evaluated in any of the cultivars. NBS-LRR12 and STK4 did not show differential expression in the first two times (90 minutes and 24 hours after inoculation), however, they were overexpressed with 48 hours of stress in the resistant cultivar and not significant in the susceptible cultivar, indicating a specific genotype response, although late, but that suggests participation in the defense response of the plant to the pathogen. The results obtained in this study contributed to a better understanding of the molecular characteristics of resistance genes and their participation in the defense process in grapevine, presenting the potential for the development of molecular markers and application in breeding programs.
Databáze: OpenAIRE
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