Desarrollo de sistemas de expresión y purificación de proteínas recombinantes de interés industrial

Autor: Amaranto, Marilla
Přispěvatelé: Barra, José Luís, Daniotti, José Luis, Vilcaes, Aldo Alejandro, Beltramo, Dante Miguel, Bonacci, Gustavo Roberto, Oggero Eberhardt, Marcos
Jazyk: Spanish; Castilian
Rok vydání: 2022
Předmět:
Zdroj: Repositorio Digital Universitario (UNC)
Universidad Nacional de Córdoba
instacron:UNC
Popis: Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2022 La expresión heteróloga de proteínas ha permitido la producción de las mismas a gran escala, lo que en la mayoría de los casos difícilmente se puede conseguir desde sus fuentes naturales. Este trabajo de Tesis tiene como objetivo contribuir en el campo de la biotecnología de proteínas recombinantes en tres aspectos particulares, los cuales se resumen a continuación. Por un lado, usamos a la hormona de crecimiento humana (hGH) como proteína modelo para desarrollar e implementar una nueva etiqueta de afinidad autoclivable. Como la hGH es de uso terapéutico, no puede poseer aminoácidos extras y debe comenzar con su aminoácido natural que es la fenilalanina (Phe). Para purificar una proteína recombinante se puede usar una etiqueta de afinidad, la cual permite purificar mediante cromatografía de afinidad, una proteína de interés fusionada a la misma. Las inteínas son elementos que se pueden fusionar entre una proteína de interés y una etiqueta de afinidad, permitiendo en un proceso de autoescisión, liberar a la proteína de interés sin dejarle ningún aminoácido extra. Mediante la expresión de la hGH recombinante (rhGH), desarrollamos e implementamos una nueva etiqueta de afinidad de autoescisión inducible por cambio de pH y temperatura, basada en la mini inteína Ssp DnaX. Esta etiqueta se fusionó en el C-terminal de la rhGH, y en el N-terminal de la misma se adicionó un péptido señal periplásmico. Bajo una condición de cultivo a pH 8 (que evita la autoescisión in vivo de la inteína), esta etiqueta de afinidad permitió la expresión y posterior purificación de la rhGH portando el aa Phe en el N-terminal. En conclusión, diseñamos e implementamos un nuevo sistema de expresión y purificación de proteínas recombinantes periplásmicas, en E. coli, mediante una etiqueta de afinidad autoclivable, basada en la inteína DnaX, destinado principalmente a proteínas que contienen puentes disulfuro. En segundo lugar, utilizamos a la L-lactato oxidasa (LOX) como proteína modelo, debido al interés en esta enzima que manifestaron dos empresas Nacionales (Wiener Laboratorios SAIC y NovoSens), para desarrollar un proceso biotecnológico para la producción de proteínas de uso industrial en E. coli, mediante un cultivo alimentado en un biorreactor. La LOX es una enzima biotecnológicamente importante que se utiliza en kits colorimétricos y biosensores para detectar lactato, un parámetro clave en el diagnóstico clínico, la medicina deportiva y la industria alimentaria. Mediante el uso de la LOX desarrollamos un proceso biotecnológico para la producción en E. coli de proteínas recombinantes de uso industrial en biorreactor. Produjimos la LOX de Aerococcus viridans recombinante fusionada a la etiqueta His-tag (rLOX). Mediante el análisis de esta proteína, pudimos demostrar que la enzima fusionada a la etiqueta de afinidad fue totalmente funcional tanto en un kit colorimétrico comercial para diagnóstico humano, como en un biosensor amperométrico para medir el ácido láctico en productos alimenticios, mostrando un rendimiento comparable al de las LOXs comerciales sin etiqueta de afinidad. Como el uso industrial de la enzima LOX requiere una producción a gran escala, desarrollamos un proceso de cultivo alimentado en biorreactor y obtuvimos un rendimiento aproximadamente diez veces mayor que el obtenido en Erlenmeyer. La etiqueta de afinidad nos permitió un proceso de purificación fácil y altamente eficiente, y se recuperó una rLOX de alta pureza, después de un solo paso de purificación por cromatografía de afinidad. Este es un proceso simple, rápido y económico para la producción de la enzima LOX recombinante para uso industrial. Finalmente, utilizamos la proteína terapéutica humana alfa-galactosidasa A (GLA) como proteína modelo para el desarrollo de sistemas productivos en células de mamíferos en cultivo y para la búsqueda de mutantes de dicha enzima con propiedades terapéuticas mejoradas. La GLA se utiliza en la terapia de reemplazo enzimático (ERT, por sus siglas en inglés) para el tratamiento de pacientes con la enfermedad de Fabry. A diferencia de las otras dos proteínas modelos que utilizamos, la GLA es una glicoproteína, por lo que para su expresión fue necesario utilizar células de mamíferos en cultivo (CHO y HEK). Logramos la expresión de la GLA recombinante en forma activa, tanto en células CHO adheridas como en células HEK en suspensión. Con el objeto de contribuir no sólo en el aspecto productivo de esta enzima, sino también en un desarrollo innovador, nos planteamos la búsqueda de mutantes de la GLA más activas como potenciales proteínas terapéuticas mejoradas. Expresamos y comenzamos a caracterizar un grupo de mutantes de la GLA descriptas en la literatura como potencialmente más activas y algunas combinaciones de las mismas. Si bien los resultados en este tema son preliminares, dentro de las mutantes analizadas, aquellas conteniendo deleciones en el extremo C-terminal (Δ7 y Δ10) y la mutante puntual R252T, serían más activas y estables en solución que la GLA salvaje. Estas mutantes podrían superar algunas complicaciones asociadas con la ERT actual, ya que los tratamientos con dosis más bajas de estos mutantes podrían lograr un efecto terapéutico similar o superior al del enzima de tipo salvaje. The heterologous expression of proteins has enabled their production on a large scale, which in most cases can hardly be achieved from their natural sources. The aims of this thesis contribute in three particular aspects to the field of recombinant protein biotechnology, which are summarized below. Firstly, we used the human growth hormone (hGH) as a model protein to develop and implement a new self-cleaving affinity tag. Considering that hGH is used therapeutically, it cannot have extra amino acids and must start with its natural amino acid i.e. phenylalanine (Phe). To purify a recombinant protein, an affinity tag can be used, which allows the fusion protein purification by affinity chromatography. Inteins are elements that can be fused between a protein of interest and an affinity tag, allowing (in a self-cleavage process) the protein of interest to be released without leaving any extra amino acids. Through recombinant expression of hGH (rhGH), we developed and implemented a new self-cleavage affinity tag inducible by pH and temperature change, based on mini-intein Ssp DnaX. This tag was fused to the C-terminus of rhGH, and a periplasmic signal peptide was added to the N-terminus thereof. Buffering the culture medium to pH 8 (which prevents in vivo self-cleavage of intein), the affinity tag enabled the expression and subsequent purification of rhGH carrying the aa Phe at the N-terminus. In conclusion, we designed and implemented a new system for the expression and purification of periplasmic recombinant proteins, in E. coli, by means of a new self-cleaving affinity tag, based on intein DnaX, aimed mainly to proteins containing disulfide bridges. Secondly, we used L-lactate oxidase (LOX) as a model protein, due to the commercial interest by two national companies (Wiener Laboratories SAIC and Novosens), to develop a biotechnological process for industrial purpose in E. coli, using a fed-batch culture in bioreactor. LOX is a biotechnologically important enzyme used in colorimetric kits and biosensors to detect lactate, a key parameter in clinical diagnostics, sports medicine, and the food industry. We produced the recombinant LOX from Aerococcus viridans fused to the His-tag (rLOX). Through the biochemical analysis of this protein, we were able to demonstrate that the enzyme fused to the affinity tag was fully functional in a commercial colorimetric kit for human diagnosis (Wiener Laboratorios SAIC). In addition, Novosens demonstrated that rLOX was functional in an amperometric biosensor to measure lactic acid in food products, with a performance comparable to commercial LOXs without an affinity tag. Since the industrial use of the LOX requires large-scale production, we developed a fed-batch process and obtained a yield of approximately ten times higher than in an Erlenmeyer flask. The affinity tag allowed an easy and highly efficient purification process, and a high pure rLOX was recovered after a single affinity chromatography purification step. This is a simple, rapid and inexpensive process to produce recombinant LOX enzyme for industrial use. Finally, we used the human therapeutic protein alpha-galactosidase A (GLA) as a model protein to develop a productive system in cultured mammalian cells. In addition, we searched for GLA mutants with improved therapeutic properties. GLA is used in enzyme replacement therapy (ERT) to treat patients with Fabry disease. Unlike the other two model proteins that we have used, GLA is a glycoprotein and, therefore, cultured mammalian cells (CHO and HEK) had to be used for GLA expression. We achieved the expression of recombinant GLA in an active form, both in adhered (CHO) and in suspension cells (HEK). In order to contribute, not only, to the productive aspect of this enzyme, but also to innovative development, we set out to search for more active GLA mutants as potential improved therapeutic proteins. We expressed and began to characterize a group of GLA mutants described in the literature as potentially more active, and some combinations thereof. Although the results on this topic are preliminary, the mutants containing deletions at the C-terminal end (Δ7 and Δ10) and the point mutant R252T would be more active and stable in solution than wild-type GLA. These mutants might overcome some of the complications associated with the current ERT, as lower-dose treatments of these mutants could achieve a therapeutic effect similar to or better than that of the wild-type enzyme. 2024-11-30 Fil: Amaranto, Marilla. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.
Databáze: OpenAIRE
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