Regulation of the paracellular transport of sodium in the thick ascending limb of Henle´s Loop by nitric oxide

Autor: Monzón, Casandra Margarita
Přispěvatelé: Garvin, Jeffrey L., Pignataro, Omar P.
Jazyk: Spanish; Castilian
Rok vydání: 2017
Předmět:
Zdroj: Biblioteca Digital (UBA-FCEN)
Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
instacron:UBA-FCEN
Popis: La rama gruesa ascendente del asa de Henle reabsorbe el 30% del cloruro de sodio (NaCl) filtrado por el glomérulo. Aproximadamente 60% del ión sodio (Na+) es reabsorbido a través del transporte activo transcelular. Como resultado del transporte activo de solutos, existe un voltaje luminal positivo en esta segmento, que favorece la reabsorción del Na+ restante a través de la vía paracelular. El óxido nítrico (NO) promueve natriuresis y diuresis, en parte debido a la inhibición del transporte de solutos en la rama gruesa ascendente del asa de Henle. Se sabe que el NO inhibe la reabsorción transcelular de sal, pero se desconocen sus efectos sobre la vía paracelular. Para evaluar el efecto del NO en la selectividad de esta última, comenzamos por medir los potenciales de dilución causados por la reducción de la concentración de NaCl en la solución del baño basolateral a 64/56, 32/24 ó 16/8 mM Na+/Cl- en túbulos de la rama gruesa ascendente del asa de Henle aislados y perfundidos. A partir de los diferentes potenciales de dilución calculamos el radio de permeabilidad Na+/Cl- (PNa+/PCl-). Dicho radio es una medida de permeselectividad paracelular, y encontramos que era ~2 en todos los casos. Estos datos indican que la vía paracelular en este segmento del nefrón es más selectiva para Na+ que para el ión cloro (Cl-) por un factor de 2, e indican que el transporte transcelular no se alteró de manera significativa por la dilución de NaCl en el baño basolateral. En los experimentos siguientes empleamos la solución conteniendo 32/24 mM de Na+/Cl-. Al utilizar dos dadores de NO químicamente distintos o el sustrato para la producción endógena de NO, L-arginina, se observó una disminución de PNa+/PCl-. Estos resultados demuestran que NO tiene un efecto sobre la selectividad de la vía paracelular, pero no indican específicamente cómo las permeabilidades absolutas de cada ión se ven afectadas. Para investigar el efecto del NO sobre PNa+ y PCl- individualmente, es necesario medir tanto PNa+/PCl- como la resistencia transepitelial (Rt). La Rt refleja solamente las vías de transporte conductivas y, en la rama gruesa ascendente del asa de Henle, representa mayormente la resistencia de la ruta paracelular. Bajo condiciones control, el valor de Rt hallado fue 7700 ohm-cm. Cuando se agregó L-arginina, la Rt disminuyó, y dicho efecto fue bloqueado por el inhibidor de NOS, L-NAME. Estos resultados demuestran que el NO disminuye la función de “barrera” de la ruta paracelular. A continuación medimos una vez más el efecto del NO producido de manera endógena sobre los potenciales de dilución y PNa+/PCl-. Con estos datos y los valores de Rt obtenidos, calculamos PNa+ y PCl- individualmente, hallando que el NO incrementó PNa+ un 40% y PCl- un ~100%. La mayoría de las acciones del NO en el túbulo proximal y la rama gruesa ascendente del asa de Henle están mediadas por guanosín monofosfato cíclico (GMPc). Es por esto que investigamos si este segundo mensajero está mediando los efectos del NO sobre la vía paracelular observados en nuestro modelo. El GMPc disminuyó PNa+/PCl- y Rt, provocando el aumento de PNa+ y PCl- de manera similar al NO. Estos datos sugieren que GMPc está mediando el efecto final del NO sobre las permeabilidades absolutas. El GMPc puede activar dos mediadores posteriores en la vía de señalización, la proteína quinasa dependiente de GMPc (PKG) y la fosfodiesterasa 2 (PDE2). Por lo tanto, evaluamos cuál de ellos está mediando las acciones del NO. En presencia del inhibidor de PKG, KT5823, el dador de NO no tuvo efecto significativo sobre el potencial de dilución. En contraste, cuando repetimos este experimento utilizando un inhibidor de PDE2, el dador de NO disminuyó el potencial de dilución, de manera similar a lo descripto anteriormente para aquellos experimentos donde solamente utilizamos un dador de NO. Estos datos indican que PKG, y no PDE2, es el mediador del efecto del NO sobre la ruta de transporte paracelular. La Rt y la selectividad iónica de la vía paracelular están reguladas por una familia de proteínas llamadas claudinas. La rama gruesa ascendente del asa de Henle expresa claudina-19, que ha sido anteriormente relacionada con la regulación de la permeabilidad de Na+. Además, la claudina-19 puede formar combinaciones heteroméricas y heterotípicas con las claudinas-3 y -16 en este segmento. Para evaluar si los efectos de NO sobre la vía paracelular están mediados por un poro del cual al menos la claudina-19 forma parte, medimos los potenciales de dilución en presencia o ausencia de un anticuerpo contra un dominio extracellular de la claudina-19 o contra la proteína Tamm-Horsfall (control). Cuando el anticuerpo anti-claudina-19 estaba presente, ni el dador de NO, ni el sustrato para la producción endógena de NO -L-arginina- tuvieron efecto sobre los potenciales de dilución. En presencia del anticuerpo anti-Tamm-Horsfall, el dador de NO disminuyó el potencial de dilución. Estos datos sugieren que los efectos del NO sobre la vía paracelular son mediados por un poro formado al menos por una unidad de la claudina-19. Finalmente, modelamos matemáticamente el efecto del NO sobre la concentración luminal de Na+ a lo largo de la rama gruesa ascendente del asa de Henle basándonos en nuestros resultados. Bajo condiciones control, en ausencia de NO, la concentración luminal de Na+ decae exponencialmente a 22.4 mM al final de dicho segmento. Cuando consideramos el efecto del NO sobre la vía paracelular únicamente, la concentración luminal de Na+ al final del túbulo es 33.9 mM, más alta que en control, indicando que se absorbe menos Na+. Al tener en cuenta el efecto del NO sobre la vía transcelular solamente, la concentración luminal de Na+ al final del túbulo es 46.2 mM, y al considerar su efecto sobre ambas vías combinadas, 52.5 mM. Por lo tanto, el efecto del NO sobre la ruta paracelular provoca una reducción en la reabsorción neta de Na+. La magnitud de dicha reducción es similar a aquella resultante de NO actuando sobre la ruta transcelular, pero el efecto del NO sobre ambas vías combinadas tiene una dinámica de antagonismo. Thick ascending limbs reabsorb 30% of the NaCl filtered by the glomerulus. About 60% of the Na+ is reabsorbed through active, transcellular transport while the remainder is reabsorbed via the paracellular pathway, or shunt, due to the luminal-positive voltage created as a consequence of active transport. Nitric oxide (NO) causes natriuresis and diuresis in part due to inhibition of thick ascending limb transport. NO inhibits active transcellular salt reabsorption, but the effects of NO on the paracellular pathway are unknown. We first evaluated the effect of NO on the selectivity of the shunt by measuring dilution potentials caused by reducing bath NaCl to 64/56, 32/24 or 16/8 mM Na+/Cl- and then calculating PNa+/PCl- (a measure of paracellular permeability) in isolated, perfused thick ascending limbs. We found that the PNa+/PCl- was about 2 when calculated from the three different dilution potentials. These data indicate that the paracellular pathway is selective for Na+ over Cl- by a factor of 2, and indicate that transcellular transport was not significantly affected by diluting the NaCl concentration of the bath. We used a bath Na+/Cl- concentration of 32/24 mM in all subsequent experiments. Two chemically distinct NO donors reduced PNa+/PCl-. The substrate for endogenous NO production, L-arginine, reduced PNa+/PCl- These data show that NO can affect the selectivity of the shunt. The afore-mentioned data indicate that NO alters the shunt but do not indicate specifically how the absolute permeabilities are affected. To investigate the effect of NO on absolute PNa+ and PCl- individually, it is necessary to measure both PNa+/PCl- and transepithelial resistance (Rt). Rt only reflects conductive transport pathways and is primarily reflective of the resistance of the shunt in thick ascending limbs. We found that Rt was about 7700 ohm-cm under control conditions. When L-arginine was added Rt decreased, and this effect was blocked by the NOS inhibitor L-NAME. These results show that NO is reducing the barrier function of the shunt. We again measured the effect of endogenously-produced NO on dilution potentials and consequently PNa+/PCl- . Using these values and the values for Rt we calculated absolute PNa+ and PCl-. We found that NO increases PNa+ by 40% and PCl- by nearly 100%. NO exerts most of its effects via cGMP. Thus we tested whether cGMP mediates the effects of NO on the paracellular pathway in our model. cGMP decreased PNa+/PCl- and Rt. Thus, it increased both PNa+ and PCl- in a manner similar to NO. These data suggest that the second messenger mediating the final effect of NO on absolute permeabilities is cGMP.cGMP can activate two downstream mediators, cGMP-dependent protein kinase (PKG) and phosphodiesterase 2 (PDE2). Thus, we next tested which of these mediates the actions of NO. We found that in the presence of the PKG inhibitor KT5823, the NO donor had no significant effect on dilution potentials. In contrast, when we repeated this experiment using a PDE2 inhibitor, the donor decreased the dilution potentials similar to the donor alone. These data indicate that PKG, but not PDE2, mediates the effect of NO on the shunt. Rt and the ionic selectivity of the shunt are regulated by a family of proteins called claudins. Thick ascending limbs express claudin-19 which has been reported to regulate Na+ permeability. Claudin-19 can interact to form homomeric and homotypic combinations with claudin-3 and 16. To test whether the effects of NO on the shunt are mediated by a pore formed by at least one claudin-19, we measured the effect of NO on dilution potentials in the presence or absence of an antibody against an extracellular domain of claudin-19 or Tamm-Horsfall protein as a control. We found that with the claudin-19 antibody, neither a NO donor nor the substrate for endogenous NO production L-arginine decreased dilution potentials. In the presence of the Tamm-Horsfall protein antibody, the NO donor still reduced the dilution potential. These data suggest that the effects of NO on the shunt are mediated by a tight junction pore formed by at least one claudin-19. Finally, we modeled the effect of NO on luminal Na+ concentration along the length of the thick ascending limb based on our results. Under control conditions in the absence of NO luminal Na+ falls exponentially to 22.4 mM by the end of the thick ascending limb. When the effect of NO on only the shunt was considered, the Na+ concentration by the end of the tubule was 33.9 mM, higher than in the control, indicating that less Na+ was reabsorbed. When the effects of NO on the transcellular pathway only was considered, the luminal Na+ was 46.2 mM, and 52.5 mM when both transcellular and paracellular pathways were taken into account. Thus the effects of NO on the paracellular pathway reduce net Na+ reabsorption and the magnitude of the reduction in net Na+ reabsorption caused by the effect of NO solely on the shunt is similar to that of NO acting on the transcellular route. The effect of NO on both routes combined follows an antagonistic dynamic. Fil: Monzón, Casandra Margarita. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.
Databáze: OpenAIRE
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