Purification, characterization and immobilization of basidiomycetes laccases and its use in the simultaneous degradation of rifampicin and isoniazid

Autor: Riedi, Halanna de Paula
Přispěvatelé: Maciel, Giselle Maria, Liz, Marcus Vinicius de, Brugnari, Tatiane, Helm, Cristiane Vieira
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2019
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da UTFPR (da Universidade Tecnológica Federal do Paraná (RIUT))
Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR)
instacron:UTFPR
Popis: A rifampicina e a isoniazida são antibióticos utilizados para o tratamento da tuberculose. Cerca de 30% dos fármacos são expelidos do corpo em sua forma inalterada e quando não tratados adequadamente em estações de tratamento de água e esgoto, podem ser responsáveis pela proliferação de cepas bacterianas resistentes. Diferentes técnicas têm sido propostas para o tratamento de fármacos no ambiente, incluindo métodos biológicos com o uso de enzimas fúngicas. Dentre elas a aplicação de lacases imobilizadas pela técnica de cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) para a biodegradação de micropoluentes é uma alternativa promissora. Nesse trabalho foram avaliadas a purificação, caracterização e a imobilização de lacases de basidiomicetos pelo método de CLEAs para posterior aplicação das enzimas como agentes biodegradadores da rifampicina e isoniazida. O trabalho foi dividido em seis etapas, sendo essas: (1) produção de lacases por basidiomicetos, resultando em atividades máximas para Trametes sp. de 9413,91 U/L e para Pleurotus ostreatus de 12296,03 U/L; (2) imobilização das enzimas em CLEAs no qual obteve-se taxa de 16,42% de imobilização; (3) purificação das lacases obtidas por precipitação com (NH4)2SO4, diálise e cromatografia em gel gerando atividade específica de 7,77 U/mg para Trametes sp. e 6,3 U/mg para P. ostreatus; (4) caracterização das enzimas com relação aos efeitos do pH, temperatura e determinação das constantes cinéticas, na qual foi possível observar que para as duas lacases o pH ótimo foi 4,0, com estabilidade na faixa de 3,0 a 5,0 e temperatura ótima de 60°C e termoestabilidade entre 20 a 50°C por 1 hora. Já para as enzimas imobilizadas notou-se aumento na estabilidade em relação a todos os pHs e na temperatura de 20 a 60°C. Para as lacases livres de Trametes sp. o Km foi de 1 mM e Vmax de 454 µmol/min e para os CLEAs foi 3,94 e 140,84 respectivamente. Para a enzima livre de P. ostreatus o Km foi de 2,1 mM e Vmax de 1000 µmol/min enquanto que a imobilizada apresentou Km de 2,57 mM e Vmax de 70,42 µmol/min; (5) a biodegradação simultânea dos fármacos resultou em melhor desempenho no tratamento da isoniazida utilizando as enzimas imobilizadas com 71% de remoção para Trametes sp., enquanto a aplicação da lacase livre resultou em 32%. Para o fungo P. ostreatus os resultados foram similares, com 68,8% de remoção utilizando CLEAs e 26,4% com enzimas livres. Para a rifampicina não houve diferença significativa entre os dois tratamentos, sendo que ambos apresentaram mais de 93% de remoção total; (6) as análises antimicrobianas das soluções após os tratamentos enzimáticos demonstraram que a rifampicina ainda conservava suas propriedades, inibindo crescimento em baixas concentrações de 0,22 mg/L. Rifampicin and isoniazid are antibiotics used for the treatment of tuberculosis. Around 30% of pharmaceuticals are expelled from the body in its unchanged form and when are not properly treated in the sewage treatment plants can be responsible for the proliferation of resistant bacteria. Different techniques have been proposed for the treatment of pharmaceuticals in the environment, including biological methods with the use of fungal enzymes. Between them the application of immobilized laccases by cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) for the biodegradation of micropolutants is a promising alternative. In this study were evaluated the purification, characterization and immobilization of laccases from basidiomycetes by CLEAs technique for subsequent application of the enzymes as biodegradant agents of rifampicin and isoniazid. The paper was divided into six steps, being these: (1) laccase production by basidiomycetes, resulting at maximum activity for Trametes sp of 9412,91 U/L and for Pleurotus ostreatus 12296,03 U/L; (2) enzyme immobilization by CLEAs obtaining 16,42% of enzimatic immobilization; (3) purification of laccases obtained by precipitaion with (NH4)2SO4, dialysis and gel chromatography with specific activity of 7,77 U/mg for Trametes sp. and 6,3 U/mg for P. ostreatus; (4) characterization of the enzymes with respect to the effects of pH, temperature and determination of the kinetic constants, where it was possible to observe that for both laccases the optimum pH was 4,0 and stability between 3,0 and 5,0 and optimum temperature of 60 °C and thermostability between 20°C to 50 °C for 1 hour. For the immobilized enzyme were observed stability increase for all pHs and in temperature between 20 to 60°C. Free lacases of Trametes sp. obtained Km of 1 mM and Vmax of 454 µmol/min, while CLEAs obtained 3,94 and 140,84, respectively. For P. ostreatus free enzyme the Km was 2,1 mM and Vmax 1000 µmol/min, while immobilized obtained Km of 2,57 mM and Vmax of 70,42 µmol/min; (5) pharmaceuticals simultaneous biodegradation resulted in higher treatment performance of isoniazid using immobilized enzymes with 71% removal for Trametes sp. while free laccase displayed 32%. P. ostreatus had similar results, with 68,8% for CLEAs and 26,4% with free enzymes. Rifampicin didn’t have significant difference between treatments, with both removing more than 93%; (6) antimicrobial analysis after enzymatic treatment revealed that rifampicin still had antimicrobial properties, inhibiting growth in low concentrations of 0,22 mg/L.
Databáze: OpenAIRE
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