Determination of changes induced by a biotic elicitor in the metabolic profile and enzymatic activity of in vitro cultures of Piper cumanense
| Autor: | Santamaría Torres, Mary Andrea |
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| Přispěvatelé: | Prieto Rodríguez, Juliet Angélica, Modesti Costa, Geison, Arias, Juan Pablo, Zabala Arias, Mario |
| Jazyk: | Spanish; Castilian |
| Rok vydání: | 2020 |
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| Zdroj: | Repositorio Universidad Javeriana Pontificia Universidad Javeriana instacron:Pontificia Universidad Javeriana |
| Popis: | Las plantas están constantemente expuestas a diferentes factores bióticos y abióticos, por lo cual deben adaptar su perfil metabólico para defenderse mediante la biosíntesis de metabolitos secundarios. Estos metabolitos aislados o en extracto tienen propiedades aprovechables en el campo farmacéutico, cosmético, agroquímico, alimentario, entre otros. Sin embargo, obtener grandes cantidades de un compuesto natural para estudios que abarquen desde la elucidación estructural, ensayos de diferentes actividades biológicas y hasta su comercialización representa un gran desafío, puesto que, una de las principales limitantes en el estudio de estos metabolitos es la baja cantidad con que se producen en la planta, trayendo como consecuencia un bajo rendimiento en los compuestos purificados, por ello la mayoría de los aportes científicos, si bien representan un avance indiscutible, suele ser información que sólo queda como aporte al conocimiento. Una herramienta biotecnológica utilizada para superar estas limitaciones es el cultivo in vitro de células y tejidos vegetales que, bajo condiciones de elicitación inducen la producción de metabolitos de defensa en las plantas y en consecuencia las enzimas asociadas a su biosíntesis. Piper cumanense es una especie cuyo extracto, aceite esencial y metabolitos aislados han mostrado una prometedora actividad antifúngica, sin embargo, su bajo rendimiento ha impedido realizar investigaciones más profundas a nivel experimental y comercial, lo que ha incentivado la necesidad de buscar una alternativa que permita no sólo la producción de la especie in vitro sino la producción in vitro de sus metabolitos de una forma controlada, permanente y sostenible. Teniendo en cuenta lo anterior, en esta investigación se determinaron los cambios metabólicos en cultivos in vitro de Piper cumanense bajo condiciones de elicitación biótica, y mediante un enfoque enzimático se estimó si estos cambios estuvieron relacionados con las actividades de las enzimas fenilalanina amonio liasa y peroxidasa. Para este propósito, las plántulas in vitro de 5 meses de edad y las suspensiones celulares fueron fortificadas con extracto de micelio acuoso autoclavado de Fusarium solani durante 5 y 15 días para las plántulas in vitro y por 24 y 72 horas para las células en suspensión. Los metabolitos secundarios fueron analizados por cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) y la evaluación de la actividad enzimática de PAL y peroxidasa se realizó espectrofotométricamente. Se encontró que el perfil cromatográfico de los extractos obtenidos de suspensiones celulares y de plántulas in vitro variaban significativamente entre sí. Metabolitos secundarios como fenilpropanoides y terpenos fueron detectados en plántulas in vitro, por el contrario, las suspensiones celulares estaban mayormente compuestas por ácidos grasos. Además, la elicitación en plántulas in vitro durante 5 y 15 días aumentó la producción de apiol y fitol respectivamente, y en ambos casos hubo una sobreexpresión del compuesto No identificado 14 considerado producto directo del proceso de elicitación. Por el contrario, la elicitación de suspensiones celulares durante 24 h no mostró ningún efecto sobre el perfil metabólico, sin embargo, con una exposición de 72 h los fitoesteroles aumentaron significativamente. A nivel enzimático se encontró en plántulas in vitro una inducción significativa de actividad PAL a los 5 días y de peroxidasa a los 15 días de tratamiento, correlacionados con el contenido de miristicina y fitol, respectivamente. En contraste, la elicitación no tuvo efecto sobre ninguna de las dos enzimas en las suspensiones celulares, lo que podría explicar, al menos en parte, la baja producción detectada de metabolitos secundarios. El enfoque utilizado en esta investigación permitió detectar cambios en el perfil metabólico y enzimático de las plántulas in vitro y dejó una evidencia clara que bajo las condiciones de análisis se necesita de cierto grado de diferenciación y madurez celular para que se dé la biosíntesis de metabolitos secundarios. Plants are constantly exposed to different biotic and abiotic factors, so they must adapt their metabolic profile to defend through the biosynthesis of secondary metabolites. These isolated or extract metabolites have usable properties in the pharmaceutical, cosmetic, agrochemical, and food fields, among others. However, large amounts of a natural compound are needed for studying structural elucidation, testing of different biological activities and even its loading. Obtaining such amounts represents a great challenge, since one of the main limitations is the low amount produced in the plant, resulting in a low performance in the purified compounds. Although representing an indisputable advance, most of the scientific contributions only remains as a contribution to knowledge. A biotechnological tool used to overcome these limitations is the in vitro cultivation of plant cells and tissues, which, under the elicitation conditions, induce the production of defense metabolites in plants and consequently the enzymes associated with their biosynthesis. Piper cumanense is a species whose extract, essential oil and isolated metabolites have shown promising antifungal activity; however, its low yield has prevented further research at an experimental and commercial level, which has encouraged the need to search for an alternative that allows not only the production of the species in vitro but the in vitro production of its metabolites in a controlled, permanent and sustainable way. Taking into account the above, in this research the metabolic changes in in vitro cultures of Piper cumanense were determined under conditions of biotic elicitation. Moreover, by an enzymatic approach it was estimated whether these changes related to the activities enzyme’s phenylalanine ammonium lyase and peroxidase. For this purpose, the 5-month-old in vitro seedlings and cell suspensions were fortified with autoclaved aqueous mycelium extract from Fusarium solani for 5 and 15 days for in vitro seedlings and for 24 and 72 hours for cells in suspension. Secondary metabolites were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and the enzymatic activity of PAL and peroxidase was evaluated spectrophotometrically. The chromatographic profile of the extracts obtained from cell suspensions and seedlings in vitro was found to vary significantly from each other. Secondary metabolites such as phenylpropanoids and terpenes were detected in seedlings in vitro, on the contrary, the cell suspensions were mostly composed of fatty acids. Furthermore, elicitation in seedlings in vitro for 5 and 15 days affected the production of apiol and phytol respectively, and in both cases there was an overexpression of the unidentified compound 14, a direct product of the elicitation process. In contrast, elicitation of cell suspensions for 24 h does not show any effect on the metabolic profile; however, with a 72 h exposure, phytosterols increased significantly. In an enzymatic level in in vitro seedlings it was found a significant induction of PAL activity at 5 days and peroxidase at 15 days of treatment, correlated with the content of myristicin and phytol, respectively. In contrast, elicitation had no effect on any enzyme in cell suspensions, which may explain, at least in part, the low detected production of secondary metabolites. The approach used in this research detected changes in the metabolic and enzymatic profile of the in vitro seedlings and clearly evidenced that under the conditions of analysis a certain degree of differentiation and cellular maturity is required for the biosynthesis of secondary metabolites to occur. Magíster en Ciencias Biológicas Maestría |
| Databáze: | OpenAIRE |
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