Construção de cromossomo artificial para Komagataella phaffii
| Autor: | Piva, Luíza Cesca |
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| Přispěvatelé: | Reis, Viviane Castelo Branco, Torres, Fernando Araripe Gonçalves |
| Jazyk: | portugalština |
| Rok vydání: | 2019 |
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| Zdroj: | Repositório Institucional da UnB Universidade de Brasília (UnB) instacron:UNB |
| Popis: | Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2019. Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Komagataella phaffii é reconhecida como uma plataforma de produção de proteínas heterólogas, sendo capaz de crescer a altas densidades celulares e de produzir proteínas complexas. Novas ferramentas e construções têm permitido o uso desta levedura na produção de diversos tipos de moléculas, transformando-a em uma fonte potencial de aplicações biotecnológicas. Neste campo, as vias metabólicas do organismo são modificadas com a inserção, deleção ou manipulação de diversos genes para atingir o resultado desejado. Como obstáculos à aplicação desta levedura como plataforma biotecnológica, pode-se citar a instabilidade genética, a dificuldade de se trabalhar com grandes sequências de DNA e a necessidade de novas opções de sequências regulatórias para a manipulação de vias metabólicas. As soluções para estes problemas passam pelo desenvolvimento de ferramentas que permitam uma montagem mais rápida de grandes fragmentos de DNA a fim de inserir sequências maiores e mais complexas na levedura. Neste trabalho, foram desenvolvidas novas linhagens de K. phaffii contendo duplas auxotrofias: LA3, com auxotrofia para adenina e histidina, LAU, para adenina e uracila e LAL-kan, para adenina e leucina. Vetores contendo os centrômeros nativos da levedura foram construídos e avaliados quanto à segregação mitótica e ao número de cópias na célula. Ao final, um cromossomo artificial linear foi desenvolvido e testado na linhagem LA3. O conjunto de ferramentas moleculares desenvolvido nesse projeto representa um avanço para a manipulação genética de K. phaffii. Dessa forma, vias metabólicas e sistemas de regulação serão construídos mais eficiente e rapidamente, contribuindo para que a levedura alcance seu potencial como plataforma de produção de proteínas e metabólitos. Komagataella phaffii is recognized as a heterologous protein production platform, being able to grow at high cell densities and to produce complex proteins. New tools have allowed the yeast to be used on the production of a wide range of molecules and to become a potential source of biotechnological applications. In this field, metabolic pathways are modified through insertion, deletion or manipulation of many genes in order to achieve the desired result. Obstacles in the way of using this yeast as a biotechnological platform include genetic instabilities, difficulties when working with long DNA sequences and the need for new elements and parts for metabolic pathway regulation. The solutions for these problems involve developing tools that allow faster assembly of long DNA fragments in order to build bigger and more complex heterologous constructs. In this work, double auxotrophic strains were developed for K. phaffii: LA3, auxotrophic for adenine and histidine, LAU, for adenine and uracil, and LAL-kan, for adenine and leucine. We constructed centromeric vectors which were evaluated on the basis of their mitotic segregation and plasmid copy number per cell. Finally, a linear artificial chromosome was developed and tested in strain LA3. This new set of strains and vectors will represent an addition to the K. phaffii genetic toolbox and will contribute for the construction of whole metabolic pathways and allow the yeast to reach its full potential as a protein and metabolite production platform. |
| Databáze: | OpenAIRE |
| Externí odkaz: |
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