Modelos mesoscópicos para RNA com dependência salina e para projeto de sondas ontogênicas com LNA

Autor: Izabela Ferreira da Silva
Přispěvatelé: Gerald Weber, Kira Astakhova, Mariana Torquatto Quezado Magalhães, Simone Silva Alexandre, Luciana Márcia de Oliveira, Anderson de Sá Pinheiro
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2021
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da UFMG
Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)
instacron:UFMG
Popis: FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O fenômeno de desnaturação dos ácidos nucléicos é sugerido como uma transição de primeira ordem e foi descrito por diferentes abordagens ao longo dos anos. Uma dessas abordagens é o modelo Peyrard-Bishop (PB), que consiste principalmente em descrever a dupla hélice através das ligações de hidrogênio que conectam cada par de base e a interação de empilhamento intrahélice entre pares de base adjacentes. O modelo PB obteve sucesso e concordância experimental quando aplicado à ácidos nucleicos modificados, como Inosina e TNA. A sua viabilidade computacional e capacidade de derivar parâmetros intramoleculares de temperaturas de desnaturação provê-nos uma ferramenta robusta para reinterpretar dados experimentais publicados e obter novas percepções sobre ligações de hidrogênio e interações de empilhamento em oligonucleotídeos. Além disso, também podemos usar esses parâmetros para prever a temperatura de desnaturação de sequências que não foram medidas anteriormente. Uma parametrização em falta para o modelo PB é para RNA em baixas concentrações de sal, devido `a quantidade limitada de temperaturas de desnaturação publicadas. Embora o modelo PB tenha sido amplamente independente das concentrações de fita em parametrizações anteriores, requer-se que todas as temperaturas sejam fornecidas na mesma concentração de fita. Assim, adaptamos o modelo PB para lidar com múltiplas concentrações de fita e, dessa forma, pudemos fazer uso de um conjunto experimental de temperaturas para modelar a ligação de hidrogênio e as interações de empilhamento em concentrações baixas e intermediárias de sódio. Para as parametrizações, fizemos uma distinção entre pares de bases terminais e internos, e os potenciais resultantes foram qualitativamente semelhantes aos obtidos anteriormente para DNA. A principal diferença em relação aos parâmetros de DNA foi o potencial de Morse em baixas concentrações de sódio para o terminal r(AU), que é mais forte do que d(AT), sugerindo maior intensidade da ligação de hidrogênio. Outro problema em aberto é a fonte da estabilização fornecida por pares de bases quimicamente modificados. Uma dessas modificações é o locked nucleic acid (LNA) que devido à adição da ponte de metileno em seu açúcar, conforma-se semelhantemente à uma hélice de RNA. Essa alteração melhora a estabilidade geral da hélice e têm sido usada em várias aplicações, como polymerase chain reaction (PCR), small interfering RNA (siRNA) e, antisense oligonucleotides (ASOs). No entanto, a fonte da melhoria da estabilidade ainda não é claramente compreendida. Estudos têm sugerido uma mudança favorável na entropia, entalpia ou em ambas, da hélice modificada, que é principalmente relacionada à um aumento nas interações de empilhamento de pares de bases vizinhos. Entretanto, o maior desafio está em compilar conjuntos contendo medidas suficientes de temperatura de desnaturação em condições experimentais semelhantes e na parametrização do modelo. Felizmente, devido à popularidade do LNA conseguimos coletar um conjunto com mais de 300 medidas de temperatura. Derivamos um conjunto completo de parâmetros para a inserção única de LNA em sequencias de DNA e, ao contrário das suposições anteriores, encontramos ligações de hidrogênio mais fortes nos pares de bases modificados e suas interações de empilhamento mostraram pouca mudança. A parametrização completa dos pares de bases do LNA permite a otimização do seu uso em sondas de oncogene e outros tipos de aplicações. Portanto, n´os utilizamos os parâmetros para prever todas as inserções de LNA possíveis em variantes dos oncogenes BRAF, KRAS e EGFR. As sondas foram selecionadas a partir do conjunto de predições de temperatura, sintetizadas e a temperatura de desnaturação medida, a precisão das temperaturas medidas comparadas com as temperaturas preditas foi menor que 1 ◦ C. The melting process of nucleic acids is suggested to be a first-order transition and has been described by different approaches over the years. One such approach is the Peyrard-Bishop (PB) model which mainly consists of describing the helix through the hydrogen bonds connecting each base pair and the intra-helix stacking interaction between adjacent bases. The PB model exhibited success and experimental accordance when applied to modified nucleic acids, such as Inosine and threose nucleic acid (TNA). Its computational feasibility and capability to derive intra-molecular parameters from melting temperatures provide us with a robust tool to reinterpret published experimental data and achieve new insights over hydrogen bonds and stacking interactions in oligonucleotides. Moreover, the PB model parameterization also allows us to use those derived parameters to predict the melting temperature of non-measured sequences. One missing parameterization for the PB model is RNA at low salt concentrations, due to the limited amount of published melting temperatures. Although the PB model was found to be largely independent of strand concentrations, it requires that all temperatures are provided at the same strand concentrations. We adapted the PB model to handle multiple strand concentrations and in this way, we were able to make use of an experimental set of temperatures to model the hydrogen bond and stacking interactions at low and intermediate sodium concentrations. For the parameterizations, we make a distinction between terminal and internal base pairs, and the resulting potentials were qualitatively similar as we obtained previously for DNA. The main difference from DNA parameters, was the Morse potentials at low sodium concentrations for terminal r(AU) which is stronger than d(AT), suggesting higher hydrogen-bond strength. Another open problem is the source of the stabilization provided by chemically modified base pairs. One such modification is the locked nucleic acid (LNA), which due to the methylene bridge addition in the sugar moiety mimics the conformation of an RNA helix. This change improves the overall stability of the helix and has been used in several applications such as in polymerase chain reaction (PCR), small interfering RNA (siRNA), and antisense oligonucleotides (ASOs). However, the source of the stability improvement is not clearly delineated yet. Studies have suggested a favorable change either in the entropy, enthalpy, or both, of the modified helix, which is mainly driven by an enhancement in the stacking interactions of neighboring base pairs. The major challenge lies in compile sets containing sufficient measurements of melting temperature at similar buffer conditions and in the model parameterization. Fortunately, due to LNA popularity, we were able to collect a data set of over 300 temperature measurements. We have derived a complete set of parameters for the LNA insertion in DNA sequences and contrarily from the previous assumptions we have found stronger hydrogen bonding in the modified base pairs and their stacking interactions have shown little change. A complete parameterization of LNA base pairs allows the optimization of their use in oncogene probes and other types of applications. Therefore, we used the parameters to predict all possible LNA insertions in oncogene variants of BRAF, KRAS and EGFR. The probes were selected from the pool of temperature predictions, synthesized and their melting temperature measured, the accuracy of the measurements with the predictions was of 1 ◦C.
Databáze: OpenAIRE
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