Pós-genoma de fungos patogênicos humanos : identificação de novas drogas contra os alvos moleculares TRR1 e KRE2 de Paracoccidioides lutzii

Autor: Abadio, Ana Karina Rodrigues
Přispěvatelé: Martins, Natália Florêncio, mailto: anakarina.abadia@gmail.com, Felipe, Maria Sueli Soares
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2012
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da UnB
Universidade de Brasília (UnB)
instacron:UNB
ISSN: 0608-0758
Popis: Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. A incidência e a gravidade das micoses sistêmicas têm crescido em níveis alarmantes em todo mundo. O principal fator que tem contribuído para esta casuística é o aumento de pacientes imunocomprometidos graves ou doentes de AIDS, submetidos à quimioterapia, ou terapias imunosupressoras para transplante de órgãos ou de células hematopoiéticas. Estes pacientes, além de desenvolverem formas clínicas mais severas das micoses, geralmente fatais, estão mais susceptíveis a infecções por fungos oportunistas. Em adição, a resistência às drogas atualmente disponíveis e os efeitos colaterais causados por estas terapias, apontam para a relevante necessidade de desenvolvimento de novas drogas antifúngicas. Por genômica comparativa foi avaliada a presença de 57 genes-alvos (55 essenciais e 2 relevantes para a sobrevivência do patógeno no hospedeiro) no genoma de nove fungos patogênicos: Paracoccidioides brasiliensis (isolados Pb18 e Pb3), P. lutzii (isolado Pb01), Aspergillus fumigatus, Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans e Histoplasma capsulatum. Esta análise possibilitou a seleção de 10 genes, que apresentavam características que os descreviam como potenciais alvos para drogas. Apenas dois alvos, tioredoxina redutase (TRR1) e α-1,2- manosiltransferase (KRE2), possuem estruturas tridimensionais (3D) homólogas e depositadas no banco de dados de proteínas (PDB), com identidade de sequência primária superior a 50%. Por essa razão eles foram selecionados para realização de modelagem molecular e varredura virtual. Os modelos TRR1 e KRE2 de P. lutzii (isolate 01) e as moléculas das quimiotecas Chimiotèque Nationale e Life Chemicals foram preparados para varredura virtual. O resultado do docking possibilitou a seleção de 20 moléculas contra o alvo molecular TRR1 e 34 moléculas contra KRE2, totalizando 54 moléculas potenciais, e destas 22 foram testadas quanto a suas potenciais atividades antifúngicas contra fungos patogênicos. As melhores moléculas foram F0608-0758 (contra KRE2) e F1806-0122 (contra TRR1), nas concentrações de 2PM (1Pg/mL) e 19PM (8Pg/mL), respectivamente, para o MIC50 (capacidade de inibir 50% do crescimento de fungos do gênero Paracoccidioides spp). Em paralelo, foi realizada a expressão heteróloga em Escherichia coli da enzima TRR1 de P. lutzii (Pb01), o que permitiu iniciar os experimentos de caracterização enzimática e inibição desta flavoenzima, utilizando a tioredoxina de Saccharomyces cerevisiae (Trx3) como substrato. Os valores dos parâmetros cinéticos determinados foram Km = 4,12 PM e Vmáx = 0,008 PM/s. Ensaios iniciais de inibição da TRR1, utilizando as moléculas selecionadas por varredura virtual, sugerem uma inibição competitiva sobre o alvomolecular TRR1, o que indica que a atividade antifúngica observada nos ensaios in culture contra os fungos patogênicos humanos era devido à inibição provocada especificamente sobre o sítio catlítico do alvo-molecular. Considerando uma concentração de 0,5 PM do substrato Trx3, a porcentagem de inibição da TRR1 recombinante pela droga F0876-0030 a 65 nM foi de 35%. Para a droga F1806-0122 (155 nM inibiu cerca de 30%) foi possível calcular o valor de IC50, em cerca de 310 nM de droga. Desta forma, novas moléculas com atividade antifúngicas foram identificadas e selecionadas apontando para um novo horizonte no desenvolvimento de novas drogas para o tratamento das infecções fúngicas invasivas. The incidence and severity of mycoses have grown to alarming levels in the world. The main factor that has contributed for this is the increase of severe immunocompromised patients or patients with AIDS, undergoing chemotherapy, or therapies for organ or hematopoietic cells transplantation. These patients also develop more severe clinical mycoses forms, particularly fatal and are more susceptible to infections by opportunistic fungi. In addition, the drugs resistance and side effects caused by the available therapies demonstrated the need of new antifungal drugs development. By comparative genomics it was evaluated the presence of 57 target genes (55 essentials and 2 important for cell viability within host pathogen) in genome of nine pathogenic fungi: Paracoccidioides brasiliensis (isolates Pb18 and Pb3), P. lutzii (isolate 01), Aspergillus fumigatus, Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans and Histoplasma capsulatum. This analysis allowed the selection of 10 genes that present characteristics that describe them as potential targets for drugs. Only two targets, thioredoxin reductase (TRR1) and α-1,2-mannosyltransferase (KRE2) present homology three-dimensionall (3D) structures in protein data bank (PDB), with primary sequence identity greater than 50%. By this reason they were selected to perform molecular modeling and virtual screening. The models TRR1 and KRE2 of P.lutzii (isolate 01) and the molecules of Chimiotèque Nationale and Life Chemicals database were prepared to virtual screening. The docking results allowed the selection of 20 molecules against TRR1 molecular target and 34 molecules against TRR1, in total of 54 potential molecules, which 22 were tested for their potential antifungal activity against pathogenic fungi. The best molecules were F0608-0758 (against KRE2) e F1806-0122 (against TRR1), in concentrations of 2PM (1Pg/mL) and 19PM (8Pg/mL), respectively, for MIC50 (ability to inhibit 50% growth of Paracoccidioides spp.). In parallel, it was performed the heterologous expression in Escherichia coli of TRR1 enzyme of P. lutzii (Pb01), allowing start the experiments of enzymatic characterization and flavoprotein inhibition, using Saccharomyces cerevisiae thioredoxin (Trx3) as substrate. The kinetic parameters values determined were Km=4,12PM and Vmáx=0,008 PM/s. Preliminary inhibition assays of TRR1, using the molecules selected by virtual screening, suggest an competitive inhibition of TRR1 molecular target and indicate that the antifungal activity in culture assays against the human pathogenic fungi was due specific inhibition of molecular target active site. With Trx3 substrate at 0.5 PM, the inhibition percentage of recombinant TRR1 by F0876-0030 drug at 65 nM was 35%. For F1806-0122 drug (155 nM inhibited about 30%) it was possible calculate IC50 value around 310 nM of drug. Thus, new molecules with antifungal activity were identified and selected, pointing to a new horizon in the new drugs development for the treatment of invasive fungal infections.
Databáze: OpenAIRE
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