Análise da proteína Kin associada à matriz nuclear em linhagens celulares de murino
| Autor: | Polizelli, Lorena Gomes, 1994 |
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| Přispěvatelé: | Fernandez, Maria Aparecida, Rosado, Adriana Fiorini, Rando, Fabiana dos Santos, 1987, Universidade Estadual de Maringá, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas |
| Rok vydání: | 2018 |
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| Zdroj: | Repositório Institucional da Universidade Estadual de Maringá (RI-UEM) Universidade Estadual de Maringá (UEM) instacron:UEM |
| Popis: | Orientador: Prof.ª Dr.ª Maria Aparecida Fernandez Coorientador: Prof.ª Dr.ª Anelise Cardoso Ramos Dissertação (mestrado em Ciências Biológicas)--Universidade Estadual de Maringá, 2018 Resumo: A detecção e o tratamento do melanoma são considerados um dos principais desafios da oncologia devido à variabilidade no nível molecular e à heterogeneidade celular dessa doença. Acredita-se que as instabilidades estruturais e genéticas, características marcantes do câncer, sejam a força no desenvolvimento dessa heterogeneidade de células tumorais que proporcionam ao tumor uma variedade de subclones para seleção de resistência a muitas formas de terapia. A estrutura nuclear pode ser utilizada como uma ferramenta de diagnóstico para distinguir uma célula normal de uma célula cancerígena, principalmente em relação à análise da subestrutura nuclear dinâmica, a matriz nuclear. A matriz nuclear desempenha um papel na organização da cromatina, além de apresentar um papel funcional em eventos que levam à instabilidade genômica e mudanças no conteúdo de DNA. Acredita-se que a organização do DNA em interfase seja realizada pela interação do DNA em locais específicos com um sistema de matriz nuclear que, como subcomponente estrutural dinâmico do núcleo, direciona a organização tridimensional do DNA em domínios de alças de DNA (loops) e fornece sítios para o controle específico de transporte de proteínas e ácidos nucleicos intranucleares. Esta estrutura é essencialmente desprovida de histonas e lipídios, e nas células tumorais, a composição proteica da matriz nuclear é alterada, alterações que podem ser úteis marcadores tumorais. Dentre as proteínas encontradas superexpressas em células tumorais, o estudo da função da proteína KIN torna-se importante. KIN, anteriormente denominada kin17, foi originalmente identificada em células de ratos com base na reatividade cruzada de anticorpos contra a proteína RecA de Escherichia coli, que está envolvida na estabilidade do genoma como mediador da via de reparo de DNA, conhecida como resposta SOS. KIN é uma proteína de ligação de DNA e RNA de aproximadamente 45 kDa, expressa de forma housekeeping em mamíferos, e inicialmente descrita como associada à iniciação da replicação, recombinação e reparo do DNA. A proteína KIN foi relatada como sendo superexpressa na maioria das linhagens tumorais analisadas e está localizada principalmente no núcleo, envolvida em processos celulares complexos, como replicação do DNA e resposta celular ao dano do DNA. Além disso, estudos anteriores mostraram que a regulação positiva de KIN está associada à proliferação, quimiorresistência e radiorresistência em tumores. No entanto, o papel dessa proteína na invasão de tumores e metástases ainda é desconhecido. Através de técnicas de imunofluorescência e microscopia eletrônica, KIN mostrou-se associada à cromatina, sugerindo um papel dessa proteína na replicação do DNA. Além disso, KIN também foi identificada entre as proteínas encontradas no spliceosoma humano, sugerindo um possível papel no metabolismo do RNA devido aos seus domínios de ligação ao RNA. Foi demonstrado que a superexpressão desta proteína poderia levar a alterações conformacionais na cromatina, confirmando sua associação com cromatina e principalmente com DNA curvo. O gene KIN é conservado em diferentes espécies, entre eles: Homo sapiens, Mus musculus, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Brugia malayi, Schizosaccharomyces pombe, entre outros, indicando uma atividade funcional básica. Nessa área de estudo propomos descrever a provável localização da proteína KIN na matriz nuclear através da utilização de técnicas de imunofluorescência e Western Blot, em linhagens celulares de murinos, sendo elas, a linhagem primária de melanoma B16F10-Nex2 e seus dois clones B168HR (melanoma metastático) e B1610CR (melanoma não metastático), e também a linhagem GMA32 (fibroblasto de pulmão de hamster chinês) usada como um controle positivo. A matriz nuclear foi extraída através de protocolos padrões com LIS (diiodosalicylato de lítio) e alta concentração de sal, e para a detecção da proteína KIN utilizamos o anticorpo contra a região RecA da proteína. Como controles foram utilizados anticorpos específicos marcadores de proteínas nucleares e da matriz nuclear. Os resultados obtidos neste trabalho confirmam a co-localização da proteína KIN associada ao núcleo e à matriz nuclear em todas as linhagens celulares analisadas. Através da análise por Western Blot, em amostras de fração nuclear, a expressão dessa proteína foi significativamente maior no clone B1610CR, e nas amostras de matriz nuclear, nos clones de melanoma B168HR e B1610CR. Por ser um tipo heterogêneo de câncer e devido as linhagens tumorais serem instáveis in vitro, passagens celulares dão origem a clones com características únicas. Desse modo, a análise em células de melanoma é importante para determinar se o nível da proteína KIN pode ser usado como biomarcador de acordo com sua agressividade Abstract: The detection and treatment of melanoma are considered one of the main challenges of oncology due to the variability in the molecular level and the cellular heterogeneity of this disease. Structural and genetic instabilities, a hallmark of cancer, are believed to be the force in the development of this heterogeneity of tumor cells that provide the tumor with a variety of subclones for selection of resistance to many forms of therapy. The nuclear structure is used as a diagnostic tool to distinguish a normal cell from a cancer cell, mainly in relation to the analysis of the dynamic nuclear substructure, the nuclear matrix. The nuclear matrix plays a role in chromatin organization, as well as to play a functional role in events leading to genomic instability and changes in DNA content. It is believed that the interphase DNA organization is performed by the interaction of the DNA at specific sites with a nuclear matrix system which, as a dynamic structural subcomponent of the nucleus, directs the three-dimensional organization of DNA in loop domains and provides sites for the specific control of transport of proteins and intranuclear nucleic acids. This structure is essentially devoid of histones and lipids, and in tumor cells, the proteinaceous composition of the nuclear matrix is altered, changes that may be useful tumor markers. Among the proteins found to be overexpressed in tumor cells, the study of KIN protein function becomes important. KIN, previously called kin17, was originally identified in mice cells based on cross-reactivity to antibodies against the RecA protein from Escherichia coli, which is involved in the genome stability as a mediator of the DNA repair pathway known as the SOS response. KIN is a approximately 45 kDa DNA and RNA binding protein expressed as housekeeping in mammals and initially described as associated with the initiation of DNA replication, recombination and repair. KIN protein was reported to be overexpressed in most of the tumor lines analyzed and is mainly located in the nucleus involved in complex cellular processes such as DNA replication and cellular response to DNA damage. In addition, previous studies have shown that the positive regulation of KIN is associated with proliferation, chemoresistance and radioresistance in tumors. However, the role of KIN17 in tumor invasion and metastasis is still unknown. Through immunofluorescence techniques and electron microscopy, KIN has been shown to be associated with chromatin, suggesting a role of this protein in DNA replication. In addition, KIN was also identified among the proteins found in the human spliceosome, suggesting a possible role in RNA metabolism due to its RNA binding domains. It has been shown that overexpression of this protein could lead to conformational changes in the chromatin, confirming its association with chromatin and mainly with curved DNA. The KIN gene is conserved in different species, among them: Homo sapiens, Mus musculus, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Brugia malayi, Schizosaccharomyces pombe, among others, indicating a basic functional activity. In this area of study, we propose to describe the probable location of the KIN protein in the nuclear matrix through the use of immunofluorescence and Western Blotting techniques in murine cell lines, being the primary lineage of melanoma B16F10- Nex 2 and its two clones B16-8HR (metastatic melanoma) and B16-10CR (nonmetastatic melanoma), as well as the GMA32 (Chinese hamster lung fibroblast) cell line used as a positive control. The nuclear matrix was extracted by standard protocols with LIS (lithium diiodosalicylate) and high salt concentration, and for detection of KIN protein, we used the antibody against the RecA region of the protein. As controls, specific antibodies to nucleic and nuclear matrix markers were used. The results obtained in this work confirm the co-localization of the KIN protein associated with the nucleus and the nuclear matrix in all cell lines analyzed. Through Western Blotting analysis, in nuclear fraction samples, in the B1610CR clone, and in nuclear matrix samples, the higher signal was revealed in the B168HR and B1610CR melanoma clones. For being a heterogeneous type of cancer and due the tumoral lineages are unstable in vitro, cell passages originate clones with unique characteristics. Thus, analysis in melanoma cells is important in determining if the level of the KIN protein can be used as a biomarker according to its aggressiveness |
| Databáze: | OpenAIRE |
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