Desenvolvimento e validação de sistemas baseados em Lamp (amplificação isotérmica em alça) e PCR convencional para o diagnóstico da Wuchereria bancrofti em fluidos biológicos

Autor: XIMENES, Camila Viana
Přispěvatelé: CARVALHO JUNIOR, Luiz Bezerra de, MELO, Fábio Lopes de
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2017
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da UFPE
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)
instacron:UFPE
Popis: FACEPE A filariose linfática é uma parasitose, que há 17 anos, vem ocupando o segundo lugar no ranking mundial das doenças incapacitantes. O Plano Global de Eliminação da Filariose Linfática (PGEFL) tem como meta eliminar esta parasitose até o ano de 2020, e um dos pilares é o desenvolvimento de novos métodos diagnósticos. A proposta do presente estudo é desenvolver e validar sistemas baseados em LAMP e PCR convencional para o diagnóstico da FB em fluidos biológicos. Dos resultados obtidos durante a otimização da PCR convencional, foi obtido um limite de detecção de 0,1fg. Além disso a PCR convencional foi aplicada em fluidos biológicos com sucesso, sendo utilizada em 20 amostras pareadas de sangue, soro e urina. Também foi otimizada a reação de LAMP que teve como limite de detecção 1 fg e amplificação apenas do DNA da Wb diante dos outros parasitas endêmicos estudados. A LAMP também foi testada em 30 amostras coletadas no período diurno, tendo 29 amostras positivas e uma amostra negativa para OG4C3, ELISA e LAMP. Em relação a validação das técnicas, PCR e LAMP foram testadas frente a 190 amostras de soro, sendo 95 positivas e 95 negativas pelo método de ICT e FMP. A sensibilidade e especificidade do ensaio LAMP foi de 100 % para ambos os testes; para PCR, os valores foram de 97.8 % e 98.9 %, respectivamente. O ensaio LAMP apresentou o VPP e VPN de 100% mais alto que a PCR [VPP (98.9%) e VPN (97.9%)]. A técnica de PCR obteve uma acurácia de 98,4% comparada com a de 100% do LAMP. O diagnóstico é um dos pilares para o controle da bancroftose, no entanto, os ensaios de diagnóstico atualmente disponíveis não são ideais. O nosso trabalho demonstrou a possibilidade da utilização das técnicas de LAMP e PCR quando comparados os métodos, ao contrário da PCR, o ensaio LAMP não requer ciclos de amplificação por termociclagem ou utilização da eletroforese para se visualizar os resultados; seu uso no campo, portanto, é facilitado. Desta forma, as técnicas de LAMP e PCR demonstraram rapidez, simplicidade, sensibilidade e especificidade adequada para a detecção de DNA. LAMP se mostrou, ainda, de fácil aplicação, o que pode melhorar a identificação de casos com infecções de baixa intensidade e tratamento direcionado, sendo de grande importância para o controle da FB e seu programa de eliminação. Lymphatic filariasis is a parasitic disease, which for 17 years has been ranked second in the world ranking of disabling diseases. The Global Plan for the Elimination of Lymphatic Filariasis (PGEFL) aims to eliminate this parasite by the year 2020, and one of the pillars is the development of new diagnostic methods. The purpose of the present study is to develop and validate LAMP and conventional PCR based systems for the diagnosis of BF in biological fluids. From the results obtained during the optimization of conventional PCR, a detection limit of 0.1fg was obtained. In addition, conventional PCR was successfully applied to biological fluids and used in 20 paired samples of blood, serum and urine. It was also optimized the LAMP reaction that had as limit of 1 fg detection and amplification of Wb DNA only in front of the other endemic parasites studied. LAMP was also tested in 30 samples collected during the day, with 29 samples positive and one negative sample for OG4C3, ELISA and LAMP. Regarding the validation of the techniques, PCR and LAMP were tested against 190 serum samples, being 95 positive and 95 negative by the ICT and FMP method. The sensitivity and specificity of the LAMP assay was 100% for both tests; for PCR, the values were 97.8% and 98.9%, respectively. The LAMP assay presented VPP and NPV 100% higher than the PCR [VPP (98.9%) and NPV (97.9%)]. The PCR technique obtained an accuracy of 98.4% compared to 100% of LAMP. Diagnosis is one of the pillars for the control of bancroftosis, however, the currently available diagnostic assays are not ideal. Our work demonstrated the possibility of using LAMP and PCR techniques when compared to methods, unlike PCR, the LAMP assay does not require cycles of amplification by thermocycling or use of electrophoresis to visualize the results; its use in the field, therefore, is facilitated. Thus, LAMP and PCR techniques demonstrated rapidity, simplicity, sensitivity and adequate specificity for DNA detection. LAMP has been shown to be easy to apply, which may improve the identification of cases with low intensity infections and targeted treatment, being of great importance for the control of FB and its elimination program.
Databáze: OpenAIRE
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