Analysis and modeling of the galacto-oligosaccharides enzymatic synthesis
| Autor: | Schultz, Guilhermina |
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| Přispěvatelé: | Giordano, Roberto de Campos, Ribeiro, Marcelo Perencin de Arruda |
| Jazyk: | portugalština |
| Rok vydání: | 2016 |
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| Zdroj: | Repositório Institucional da UFSCAR Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR) instacron:UFSCAR |
| Popis: | Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Galactooligosaccharides are indigestible oligosaccharides with recognized prebiotic capacity. They can be synthesized enzymatically from lactose-rich substrates using the β-galactosidase enzyme by means of a kinetically controlled reaction in which they are intermediates (synthesis) in the hydrolysis reaction. The predominance of synthesis on the hydrolysis depends mainly on the concentration of lactose and origin of β-galactosidase, but it also depends on other factors, such as temperature, pH, ionic strength and water activity. Apart from pure lactose, other substrates with high concentration of lactose may be used, such as whey and whey permeate. The objective of this research was to study the enzymatic production of galactooligosaccharides (GOS) from lactose and whey permeate using free β-galactosidase from Kluyveromyces lactis to reach mathematical models that enable the use computational tools for process optimization. A rotational central composite design to verify the influence of pH, temperature and ionic strength in the initial rates of hydrolysis and synthesis, selectivity and total enzyme activity was used. Lactose (pure or present in whey permeate) were used as substrate (220 g/L) and the reactions were conducted in a potassium phosphate buffer (various concentrations) in the presence of cofactors (10 mM NaCl, and 1.5 mM MgCl2). The results showed that, within the studied region, both rates, of synthesis and hydrolysis using lactose or permeate, increase with temperature increase and pH decreases. Selectivity is maximized by increasing pH. Stability analysis of β-galactosidase Kluyveromyces lactis was also addressed. These tests were performed in presence of cofactor, incubating the enzyme in potassium phosphate buffer. The temperature was varied from 35 to 45 ° C (pH 7 and 50 mM), pH 6 to 8 (35 ° C and 50 mM) and ionic strength 25 to 200 mM (35 ° C and pH 7) and samples were collected over time. Among tested models, what best fits the experimental data is the reversible inactive intermediate model. However, this model could not predict behaviors such as those obtained when using 25, 100 and 200 mM. Fitting of kinetic models for GOS synthesis were made by nonlinear regression. Experimental data of different GOS synthesis assays employing lactose and whey permeate as substrates was used. The results showed that a simple model (which does not take into account the formation of galactobiose) does not fit the experimental data. Recent model proposed in the literature that takes into account such training, fits the data, but it has a problem of phenomenological inconsistency. The model proposed in this work fit the experimental data and does not show inconsistencies in the balance of glucose residues per galactose. Moreover, the model allows the estimation of GOS fraction formed only by galactose, which allows to discriminate disaccharides into galactobiose (having prebiotic properties) and lactose. Galacto-oligossacarídeos são oligossacarídeos não digeríveis com reconhecida capacidade prebiótica. Podem ser sintetizados enzimaticamente a partir de substratos ricos em lactose utilizando a enzima β-galactosidase por meio de uma reação controlada cineticamente, no qual são intermediários (síntese) na reação de hidrólise. O predomínio de síntese sobre a hidrólise depende essencialmente da concentração de lactose e origem da β-galactosidase, mas também depende de outros fatores como temperatura, pH, força iônica e atividade da água. Além de lactose pura, podem ser utilizados outros substratos com alta concentração de lactose, como soro de leite e permeado do soro de leite. Dessa forma, o objetivo dessa pesquisa foi estudar a produção enzimática de galacto-oligossacarídeos (GOS) a partir de lactose e do permeado do soro de leite, utilizando a enzima β-galactosidase livre oriunda da Kluyveromyces lactis com o intuito de construir modelos matemáticos que possibilitem a utilização de ferramentas computacionais para a otimização do processo. Utilizou-se um delineamento composto central rotacional para verificar a influência de pH, temperatura e força iônica nas velocidades iniciais de síntese e hidrólise, seletividade e atividade total da enzima. Foram empregados como substrato 220 g/L de lactose (pura, ou presente em permeado do soro de leite), e as reações foram conduzidas em tampão fosfato de potássio (diversas concentrações), na presença de cofatores (10 mM NaCl e 1,5 mM MgCl2). Os resultados obtidos evidenciam que, dentro da região estudada, as velocidades de síntese e de hidrólise, utilizando lactose ou permeado, ambas aumentam com elevação de temperatura e diminuição de pH. Já a seletividade é maximizada com o aumento do pH. Também foi feita análise de estabilidade da β-galactosidase de K. lactis. Estes ensaios foram realizados na presença de cofatores, incubando a enzima em tampão fosfato de potássio. Variou-se a temperatura de 35 a 45 °C (pH 7 e 50 mM), pH de 6 a 8 (35 °C e 50 mM) e força iônica de 25 a 200 mM (35 °C e pH 7) e amostras foram coletadas no decorrer do tempo. Dos modelos testados, o que se ajusta melhor aos dados experimentais é o modelo com intermediário inativo reversível. Contudo, esse modelo não é capaz de prever comportamentos como dos ensaios de força iônica de 25, 100 e 200 mM. Os ajustes dos modelos cinéticos para a síntese de GOS foram feitos por regressão não linear, e utilizaram-se dados experimentais de diferentes ensaios de síntese de GOS, empregando como substrato lactose pura e permeado do soro de leite. Nos resultados obtidos, um modelo simples (que não leva em consideração a formação de galactobiose) não se ajustou aos dados experimentais. Modelo recente proposto na literatura que leva em consideração essa formação se ajusta aos dados, mas tem um problema de inconsistência fenomenológica. O modelo proposto neste trabalho se ajustou aos dados experimentais e não apresenta inconsistências no balanço de resíduos de glicose por galactose. Além disso, o modelo possibilita a estimação da fração de GOS formados somente por galactose, o que permite discriminar os dissacarídeos em galactobiose (que têm propriedades prebióticas) e lactose. CAPES: Código de Financiamento 001 |
| Databáze: | OpenAIRE |
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