Characterization of the hNek5 and hNek10 proteins in the DNA damage response context : a functional and interatomic approach

Autor: Papa, Priscila Ferreira, 1987
Přispěvatelé: Kobarg, Jörg, 1965, Saffi, Jenifer, Lenz, Guido, Leme, Adriana Franco Paes, Santos, Aline Mara dos, Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia, Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Rok vydání: 2015
Předmět:
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron:UNICAMP
Popis: Orientador: Jörg Kobarg Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A família de proteínas serina/treonina cinases Nek (NIMA related kinases) são similares ao seu homólogo NIMA (never in mitosis, gene A), uma proteína altamente conservada e crítica para a progressão do ciclo celular em Aspergillus nidulans. O interactoma e as funções dos 11 membros das Neks (1-11) em mamíferos permitiu associá-los à tríade funcional (1) mitose/centrossomo, (2) cílio primário/ciliopatias e (3) resposta ao dano no DNA, em revisão publicada por nosso grupo (Artigo I). Dentre eles, hNek5 e hNek10 são as menos caracterizadas quanto ao seu papel biológico. Assim, ensaios de duplo híbrido para Nek5 identificaram proteínas relacionadas à processos mitocondriais, dentre elas BCLAF1, Cox11 e MTX2, e ao dano no DNA, como BCLAF1 e TOPII?. Ensaios de colocalização e fracionamento subcelular indicaram a localização mitocondrial de hNek5 e seus efeitos na resistência à morte celular através de ensaios de apoptose e viabilidade celular (Artigo II). hNek5 pode ainda estar envolvida na resposta ao dano ao DNA à diversas drogas genotóxicas causando efeitos na parada do ciclo celular, estresse replicativo e desregulação na ativação de proteínas importantes para as respostas do dano no DNA (Artigo III). O interactoma de hNek10 foi analisado através de duas abordagens: (1) Screening de duplo híbrido indicando 12 interactores e (2) Espectrometria de massas identificando 58 e 117 proteínas interactoras sem e com indução de dano no DNA, respectivamente, associadas à processos biológicos como ciclo celular mitótico, proliferação celular, expressão gênica, processamento de RNA. Dentre as proteínas, confirmamos a interação com dois membros do complexo de coesinas, SMC1 e SMC3 e a depleção de hNek10 causou multinucleação, multilobulação nuclear, acúmulo na fase G1/S do ciclo celular, foci de ?-H2AX e aumento da morte celular; sugerindo que o silenciamento de hNek10 pode sensibilizar a célula à danos endógenos de DNA (Artigo IV). Isto posto, os estudos funcionais e interactômicos de hNek5 e hNek10 presentes neste trabalho permitiram caracterizá-las em novos processos biológicos, em especial, na resposta do dano no DNA Abstract: The Nek (NIMA related kinases) family of serine/threonine protein kinases is similar to its homolog NIMA (never in mitosis, gene A), a highly conserved and critical protein for the cell cycle progression in Aspergillus nidulans. The eleven members of the Neks (1-11) in mammals share biological functions grouped by the analysis of their interactomes in a functional triad, (1) mitosis/centrossome (2) primary cilia/ciliopathies (3) DNA damage response, in a review published by our group (Article I). Among them, hNek5 and hNek10 are least characterized as their biological roles. Therefore, a yeast-two hybrid screening identified Nek5 interactors related to mitochondria processes, such as BCLAF1, Cox11 and MTX2, and to DNA damage, BCLAF1 and TOPII?. Confocal microscopy images and subcellular fractionation indicated hNek5 mitochondrial localization and, by apoptosis assay and cell viability, its effects in cellular death resistance (Article II). Also, in response to genotoxic agents, hNek5 may cause effects in cell cycle arrest, replicative stress and deregulation in the activation of crucial proteins for the correct DNA damage response (Article III). hNek10 interactome was accessed by two approaches: (1) yeast-two hybrid screening indicating 12 interactors and (2) Mass Spectrometry identifying 117 and 58 interacting partners with or without DNA damage induction, respectively, associated to several biological processes, such as mitotic cell cycle, cell proliferation, genic expression, RNA processing. Among the interacting proteins, hNek10 interacted with SMC1 and SMC3, members of the cohesin complex, by immunoprecipitation assay and hNek10 depletion caused multinucleation, nuclear multilobulation, cell accumulation in G1/S, ?-H2AX foci and cell death increased levels, suggesting that hNek10 depletion may sensitize cells to internal genotoxic effects (Article IV). Taken together, the functional and interactomic results presented here for hNek5 and hNek10 characterized or corroborated their role in biological processes already related to other hNeks, especially in DNA damage response Doutorado Genética Animal e Evolução Doutora em Genética e Biologia Molecular CNPQ FAPESP 2010/15262-2
Databáze: OpenAIRE
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