Study of IL7R gene mutagenesis and repair upon DNA breakage by CRISPR-Cas9 and implications in T- cell acute lymphoblastic leukemia

Autor: Pissinato, Leonardo Granato, 1994
Přispěvatelé: Yunes, José Andrés, 1967, Menck, Carlos Frederico Martins, Kobarg, Jörg, Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia, Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2019
Předmět:
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron:UNICAMP
Popis: Orientador: José Andrés Yunes Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Aproximadamente dez por cento das leucemias linfoide aguda pediátrica de células T (LLA-T) apresentam uma inserção de resíduo cisteína na porção justamembrana do receptor IL7R, que leva à homodimerização e sinalização constitutiva JAK/STAT, contribuindo para a leucemogênese. As mutações concentram-se em um trecho de 26pb do éxon 6 do gene IL7R e são caracterizadas por grandes inserções. A análise das mutações sugere que as mesmas têm início por quebras dupla-fita, seguidas de reparo por via NHEJ (non-homologous end joining), e a grande maioria das mutações apresenta códon cisteína, sendo que este é quase sempre formado pelas regiões inseridas, e não pelas regiões flanqueando a "cicatriz" de reparo. É possível que a enzima TdT (Terminal deoxynucleotidyl Transferase), específica de linfócitos e encarregada da adição de nucleotídeos sem sequência-molde às junções V(D)J, esteja por trás das inserções no gene IL7R. A hipótese principal deste trabalho é que quebras dupla-fita, por si sós, no hotspot mutagênico do IL7R causem a inserção de cisteína nesse sítio. Outras hipóteses levantadas também são as de que a polimerase TdT seja responsável pelas inserções observadas no IL7R, e que deficiências nas proteínas de reparo Ku70 e XRCC4, e no fator TdIF2, que exerce atividade reguladora sobre a TdT, contribuam para o aumento do tamanho dessas inserções. É esperado que, quanto maiores as inserções, maiores serão as chances de se observar um códon cisteína. Para estudar os possíveis papéis da TdT, Ku70, XRCC4 e TdIF2 no tamanho das inserções no IL7R, utilizamos tecnologia CRISPR e shRNA, em linhagem celular HPB-ALL, com o intuito de gerar quebras dupla-fita nesse hotspot mutagênico e de inibir a atividade dessas proteínas, respectivamente, a fim de comparar resultados das cicatrizes de reparo entre células com e sem atividade desses fatores através de sequenciamento de nova geração. A análise dos resultados revelou que em todas as condições de silenciamento, e também na amostra controle, houve a inserção de códon cisteína no sítio de quebra, o qual se tornou mais frequente conforme as inserções aumentaram em tamanho. Porém o silenciamento dos fatores selecionados, Ku70 principalmente, não alterou a frequência e tamanho geral das inserções. Além disso, diferente das inserções totalmente aleatórias que eram esperadas, foram observados eventos específicos nos quais o reparo foi feito utilizando diferentes moldes: sequências repetitivas (STRs), sequências específicas de outros locais genômicos e sequências adjacentes ao sítio de quebra. Interessantemente, sem atividade TdT a frequência e tamanho das inserções no sítio de quebra cai drasticamente e os eventos específicos acima mencionados deixam de ocorrer. Estes achados revelam aspectos importantes de como, em linhagens linfoides, mutações no gene IL7R são ocasionadas. Além disso, este trabalho revela também novos possíveis mecanismos de reparo e de atuação da enzima TdT, e aponta para a TdT como possível alvo de quimioterápicos para impedir o surgimento de novos clones malignos durante o tratamento da LLA Abstract: Approximately ten percent of pediatric T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) have an insertion of a cysteine residue in the justamembrane portion of the IL7R receptor, which leads to homodimerization and constitutive JAK/STAT signaling, contributing to leukemogenesis. Mutations are concentrated in a 26bp portion of éxon 6, called hotspot, of the IL7R gene and are characterized by large insertions. The analysis of this mutations suggests they are initiated by double-strand breaks (DSBs), followed by repair by NHEJ (non-homologous end joining) pathway, and most mutations presents a cysteine codon, which is almost always formed by the inserted regions, not by regions flanking the repair "scar". It is possible that the lymphocyte-specific TdT (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase) enzyme, responsible for the addition of non-templated nucleotides to the VDJ junctions, is behind the insertions observed in the IL7R gene. The main hypothesis of this work is that DNA double-strand breaks, by themselves, in the IL7R mutagenic hotspot causes insertion of cysteine codons at this site. Other hypothesis raised are that the TdT polymerase is responsible for the insertions in the IL7R, and that deficiencies in the Ku70 and XRCC4 repair proteins, as well as the TdIF2 factor, which exerts regulatory activity on TdT, contribute to increasing the size of these insertions. It is expected that, the larger the insertions, the greater the chances of observing a cysteine codon. In order to study the possible roles of TdT, Ku70, XRCC4 and TdIF2 in the size of IL7R insertions, we used CRISPR and shRNA technology in HPB-ALL cell line, with the aim of generating double-strand breaks in this mutagenic hotspot and inhibiting activity of these proteins, respectively, in order to compare results of repair "scars" between cells with and without activity of these factors through next generation sequencing. The analysis of the results showed that in all the silencing conditions, as well in the control sample, the insertion of cysteine codon at the break site was found, becoming more frequent as the insertions grew in lenght. However, the silencing of the chosen factors, Ku70 especially, did not alter the overall frequency and sizes of insertions. Furthermore, unlike the totally random insertions that were expected, specific events were observed in which the repair was done using different templates: short tandem repeats (STRs), specific sequences from other genomic sites and sequences adjacent to the breaking site. Interestingly, without TdT activity the frequency and sizes of insertions at the break site drops dramatically and the specific events mentioned above no longer occur. These findings reveal important aspects of how, in lymphoid lines, mutations in the IL7R gene are caused. In addition, this work also reveals new possible DNA repair and TdT activity mechanisms, and points to TdT as a possible target of chemotherapeutics to prevent the emergence of new malignant clones during the treatment of ALL Mestrado Genética Animal e Evolução Mestre em Genética e Biologia Molecular CAPES 001
Databáze: OpenAIRE
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