Estudo do efeito anti-inflamatório de Calea uniflora Less.: utilizando-se ensaios in vivo e in vitro

Autor: Rosa, Julia Salvan da
Přispěvatelé: Universidade Federal de Santa Catarina, Fröde, Tânia Silvia
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2017
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da UFSC
Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)
instacron:UFSC
Popis: Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2017. Introdução: Calea uniflora Less. é uma planta perene e subarbustiva, conhecida popularmente como: arnica e erva-de-lagarto. Esta planta pertence à família Asteraceae, que compreende cerca de 125 espécies, distribuídas mundialmente principalmente nas áreas tropicais e subtropicais utilizadas na medicina popular para o tratamento do reumatismo, doenças respiratórias e problemas digestivos. Objetivos: 1) Avaliar o efeito anti-inflamatório do extrato bruto, frações e compostos isolados obtidos da C. uniflora, sobre a migração dos leucócitos, lesão pulmonar, exsudação, edema, atividade de enzimas mieloperoxidase (MPO), adenosina-desaminase (ADA), concentrações de nitrito/nitrato (NOx) e de citocinas: interleucina-1ß (IL-1ß), interleucina-6 (IL-6), interleucina-10 (IL-10), interleucina-17A (IL-17A), fator de necrose tumoral-a (TNF-a), interferon-gama (IFN-?), proteína quimiotática de monócitos-1 (MCP-1), 2) Avaliar o efeito dos compostos isolados sobre a atividade das enzimas catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e glutationa S-transferase (GST) e das concentrações de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), além da fosforilação da subunidade das proteínas p65 (RelA) do fator nuclear kappa B (NF-?B) e da cinase ativada por mitógeno p38 (p38-MAPK), Ainda verificar a citotoxicidade e a apoptose de neutrófilos isolados do peritônio de camundongos. Metodologia: As folhas frescas de C. uniflora foram trituradas e submetidas a maceração em etanol 92%, para obtenção do extrato bruto (EB). Este extrato foi dissolvido em água e particionado com diferentes solventes: n-hexano, diclorometano e acetato de etila para obter as frações: hexano (Hex), diclorometano (DCM), acetato de etila (AcOEt) e resíduo aquoso (Aq). Os compostos noreugenina (NRG), orobol + buteína (OR+BU) e a-hidroxi-buteína (AH-BU) foram isolados a partir da fração DCM e da fração AcOEt, respectivamente. A elucidação dos compostos isolados foi realizada utilizando-se técnicas de cromatografia líquida a vácuo (CLV), cromatografia em coluna (CC) e análise de seus dados espectrais (1H NMR, COSY, HSQC e HMBC). Nos ensaios in vivo foram utilizados camundongos albinos Swiss. A pleurisia foi induzida segundo metodologia descrita por SALEH et al., 1996 e, foram avaliados os seguintes parâmetros inflamatórios: leucócitos, exsudação, atividades das enzimas: MPO e ADA, concentrações de NOx e de citocinas inflamatórias (IL-1ß, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF-a, IFN-?, MCP-1), enzimas anti-oxidantes (CAT, SOD e GST), TBARS, proteínas p65 e p38 totais e fosforiladas, edema, preservação e espessamento da arquitetura do septal alveolar. Estas dosagens foram realizadas em diferentes tecidos (lavado pleural e/ou tecido pulmonar). As dosagens de MPO, ADA, NOx, SOD, GST, CAT, TBARS foram realizadas por testes colorimétricos no lavado pleural e/ou tecido pulmonar. As citocinas, proteínas p65 e p38 foram mensuradas por citometria de fluxo ou enzimaimunoensaio no lavado pleural e/ou tecido pulmonar. Já análise histológica do pulmão foi realizada por coloração com Hematoxilina-eosina (HE). Para os ensaios in vitro, os neutrófilos foram obtidos do lavado peritoneal dos camundongos albinos Swiss. Neste protocolo foram analisados os parâmetros: viabilidade celular, usando solução de azul de Trypan (0,4%), a MPO, dosada por ensaio colorimétrico e apoptose, analisada por citometria de fluxo. A análise estatística dos parâmetros inflamatórios estudados foi realizada pelo teste de análise de variância (ANOVA) complementados, pelo teste de Newman-Keuls e/ou teste t de Student. Valores de p < 0,05 foram considerados significativos. Resultados: EB (50 - 200 mg/kg), Aq (10 - 50 mg/kg), Hex (10 - 50 mg/kg), DCM (5 - 50 mg/kg), AcOEt (5 - 50 mg/kg), NRG (5 - 10 mg/kg), OR+BU (5 - 10 mg/kg), AH-BU (2,5 - 10 mg/kg) inibiram: leucócitos, neutrófilos, mononucleares e exsudação (p < 0,05). Da mesma forma, EB (50 mg/kg), Aq (10 mg/kg), Hex (10 mg/kg), DCM (5 mg/kg), AcOEt (5 mg/kg), NRG (5 mg/kg), OR+BU (5 mg/kg), AH-BU (2,5 mg/kg) inibiram as atividades das enzimas MPO e ADA, as concentrações de NOx, de citocinas (IL-1ß, IL-6, IL-17A, TNF-a, IFN-?, MCP-1), e de enzimas anti-oxidantes (SOD, CAT e GST), TBARS, além da ativação do NF-?B e da p38-MAPK (p < 0,01). Ainda os compostos isolados aumentaram as concentrações da IL-10. Por fim, nos ensaios in vitro os compostos isolados reduziram a atividade de MPO e aumentaram a apoptose de neutrófilos, sem alterar a viabilidade dos neutrófilos. Conclusões: C. uniflora possui importante atividade anti-inflamatória devido principalmente à inibição do influxo de leucócitos e da exsudação. Este efeito parece ser em parte mediado pela inibição de mediadores inflamatórios, de enzimas anti-oxidantes, produtos da peroxidação lipídica, bem como um aumento da citocina anti-inflamatória (IL-10) e a indução de apoptose de neutrófilos ativados. Por fim, a noreugenina (NRG), orobol + buteína (OR+BU) e a-hidroxi-buteína (AH-BU) parecem ser, em parte, responsáveis pelo efeito anti-inflamatório apresentado pela C. uniflora por meio da inibição de vias de sinalização intracelular: NF-?B e de p38 MAPK. Abstract : Introduction: Calea uniflora Less. is a perennial and sub-shrub plant, popularly known as: arnica and erva-de-lagarto. This plant belongs to the Asteraceae family, with almost 125 species, and it is widely distributed prior to tropical and subtropical regions of the world and they are used in folk medicine for the treatment of rheumatism, respiratory diseases and digestive problems. Objectives: 1) To evaluate the anti-inflammatory effect of the crude extract, fractions and isolated compounds from C. uniflora upon: leukocyte migration, lung injury, exudation, oedema, myeloperoxidase (MPO) and adenosine deaminase (ADA) enzymes activities, nitrite/nitrate (NOx) and cytokines (interleukin-1ß (IL-1ß), interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10), interleukin-17A (TNF-a), interferon-gamma (IFN-?), monocyte-1 chemotactic protein (MCP-1)) concentrations and, 2) To evaluate the effect of the isolated compounds upon: catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and glutathione S-transferase (GST) activities, and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), concentrations, and p65 (RelA) nuclear subunit of nuclear factor kappa B (NF-?B) and kinase activated by mitogen p38 (p38-MAPK) phosphorylations, besides the cytotoxicity and apoptosis of neutrophils isolated from peritoneal in mice. Methodology: The fresh leaves of C. uniflora were triturated and submitted to maceration with ethanol 92%, to obtain the crude extract (EB). This extract was dissolved in water and partitioned with different solvents: n-hexane, dichloromethane and ethyl acetate solutions to obtain the hexane (Hex), dichloromethane (DCM), ethyl acetate (AcOEt) and residual aqueous (Aq) fractions. The isolated compounds, noreugenin (NRG), orobol + butein (OR+BU) and a-hydroxy-butein (AH-BU) were isolated from the DCM fraction and AcOEt fraction, respectively. The elucidation of the isolated compounds was performed using vacuum liquid chromatography (CLV), column chromatography (CC) and analysis of its spectral data (1 H NMR, COZY, HSQC and HMBC). In the In vivo assays it was used Swiss mice. The pleurisy was induced according to the methodology described by SALEH et al., 1996. The following inflammatory parameters were evaluated: leukocytes, exudation, MPO and ADA activities, and NOx and inflammatory cytokines (IL-1ß, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF-a, IFN-?, MCP-1) concentrations, antioxidant enzymes (CAT, SOD, GST) activities, TBARS concentration, total and phosphorylated p65 and p38 proteins, oedema, preservation and thickening of the alveolar septal architecture. These dosages were evaluated in different tissues (pleural lavage and/or lung tissue). The dosages of MPO, ADA, NOx, SOD, GST, CAT, TBARS were performed by colorimetric tests in the pleural lavage and/or lung tissue. The cytokines, p65 and p38 proteins were performed by flow cytometry or enzyme immunoassay in the pleural lavage and/or lung tissue. The histological analysis of the lung was analysed by staining with Hematoxylin-eosin (HE). For the in vitro assays, neutrophils were obtained from the peritoneal lavage of Swiss mice. In this protocol, the following parameters were analyzed: cell viability, using Trypan blue solution (0.4%), MPO, measured by colorimetric assay and apoptosis, analyzed by flow cytometry. Statistical analysis of the studied inflammatory parameters were determined by analysis of variance test (ANOVA), and complemented by test Newman-Keuls and/or Student's t test. Values of p < 0.05 was considered significant. Results: EB (50 - 200 mg/kg), Aq (10 - 50 mg/kg), Hex (10 - 50 mg/kg), DCM (5 - 50 mg/kg), AcOEt (5 - 50 mg/kg), NRG (5 - 10 mg/kg), OR+BU (5 - 10 mg/kg), AH-BU (2.5 - 10 mg/kg) inhibited leukocytes, neutrophils, mononuclears and exudation (p < 0.05). Also, EB (50 mg/kg), Aq (10 mg/kg), Hex (10 mg/kg), DCM (5 mg/kg), AcOEt (5 mg/kg), NRG (5 mg/kg), OR+BU (5 mg/kg) and AH-BU (2.5 mg/kg) inhibited the MPO and ADA activities, NOx, cytokines (IL-1ß, IL-6, IL-6, IL- IL-17A, TNF-a, IFN-?, MCP-1) concentrations, anti-oxidant enzymes (SOD, CAT and GST) activities, TBARS concentrations, and p-p65 NF-?B and p-p38 MAPK levels (p < 0.01). Also the isolated compounds increased IL-10 concentration. Finally, the isolated compounds reduced MPO activity and increased neutrophil apoptosis, without altering neutrophil viability in the in vitro assays. Conclusions: The C. uniflora present important anti-inflammatory activity mainly due to the reduction of the influx of leukocytes and exudation. This effect appears to be related, in part, by the inhibition of inflammatory mediators release, anti-oxidant enzymes, lipid peroxidation products, as well as, an increase in the anti-inflammatory cytokine (IL-10) levels and neutrophil apoptosis induction. Finally, noreugenin (NRG), orobol + butein (OR + BU) and a-hydroxy-butein (AH-BU) seems to be, in part, responsible for this anti-inflammatory effect presented by C. uniflora sice it promote intracellular pathways inhibition (NF-?B and p38 MAPK).
Databáze: OpenAIRE
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